Hedeflenen proteomik yaklaşımlar, proteinlerin kısa süreli proteomik tabanlı deneylerden veya moleküler biyoloji tabanlı deneylerden doğrulanması için tercih edilen yöntem haline gelmektedir. Çoklu reaksiyon izleme, biyolojik örneklerden elde edilen proteinleri tespit etmek ve ölçmek için giderek daha fazla kullanılan bu hedefli bir yaklaşımdır. Bu çalışmada, okuyucuları bir MRM deneyinin temel gereksinimleriyle tanıştırmak amacıyla insan beyin dokusundan proteinlerin tespit ve ölçülmesinde yer alan çeşitli adımlardan geçtik.
Yaklaşık 50 mg beyin dokusu ağırlığında ve dokuyu 300 mikrolitre 1x fosfat tamponlu salin ile yıkayın. Bu adım, dokunun dış yüzeyindeki herhangi bir kanı çıkarmak için gerçekleştirilir ve bu nedenle mümkün olduğunca fazla kan çıkarılması tavsiye edilir. PBS ile yıkamaları takiben, dokuyu içeren tüpe 300 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.
Tüpü buz banyosunda tutarken sonda sonicator kullanarak dokuyu lyse. Dokuyu tamamen izlendirmek için boncuk çırpıcı kullanarak doku homojenizasyonuna devam edin. Tüpün içeriğini 6000 g'da dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.
Süpernatant taze bir tüpe aktarın ve homojen bir şekilde karıştırın. Süpernatanttan küçük bir aliquot alın ve standart bir protein tahlili kullanarak protein içeriğini ölçün. Burada Bradford Assay kullanarak protein tahmini örneği gösteriyoruz.
Bir mikrosantrifüj tüpüne 50 mikrogram protein alın ve son konsantrasyon 20 milimolar olacak şekilde TCEP ekleyerek içeriği azaltın. İçeriği bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, tüpe iodoasetamid ekleyerek azaltılmış proteinleri alkillatın, böylece son konsantrasyon 40 milimolardır.
Tüpü 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya bırakın. Şimdi tüpe B Tamponu ekleyin, azaltılmış ve alkillenmiş proteinleri içeriyordu, böylece ürenin son konsantrasyonu bir azı dişinden az. 30 enzim-protein oranına kadar 1'de tripsin ekleyin ve tüpleri sürekli sallanarak 37 derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.
Sindirimden sonra, sindirilen peptitleri bir vakum konsantratöründe konsantre edin. Bu adımda, peptitler yeniden inşa edilebilir ve tuzdan arındırılabilir veya gelecekteki kullanım için eksi 80'de saklanabilir. Numuneleri herhangi bir LC-MS MS'e yüklemeden önce tuzdan arındırma veya peptit temizleme önemlidir. Numunedeki tuzlar ve diğer kirleticiler sütunu tıkayabilir ve uzun vadede cihazın hassasiyetini etkileyebilir.
Bu işlem, piyasada bulunan C18 STAGE ipuçları veya sütunları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada bir C18 STAGE ucu kullanarak peptit tuzdan arındırma için iş akışını tasvir ettik. Tuzdan arındırma yaptıktan sonra, peptitleri bir vakum konsantratöründe kurutun.
Bu temiz peptitleri yeniden oluşturan ve Scopes yöntemini kullanarak niceleme için devam edin. Bunun için, numunenin iki mikrolitresini bir mikro damla plakasına yükleyin ve slaytta gösterildiği gibi konsantrasyonu hesaplayın. Geçiş listesi hazırlığı, bir SRM veya MRM denemesinde çok önemli bir adımdır.
Bir geçiş listesi, geçişi izlemek için kütle spektrometresinin gerektirdiği tüm bilgileri içerir. Bu, öncül ve ürün iyonlarının m by z değerlerini, geçişin çarpışma enerjisini, cihazın polaritesini ve veri toplama zaman aralığını içerir. Skyline'ı kullanarak geçiş listesini hazırlayın.
UniProt'tan Human Proteome Fasta dosyasını kullanarak bir arka plan proteom hazırlayın ve Peptit Ayarları'nın Arka Plan sekmesi altında seçildiğinden emin olun. Filtre sekmesinde, en az 8 uzunluk ve maksimum 25 uzunluk ayarlayın. Peptitlerde başka değişiklik yoksa varsayılan ayarları kullanmaya devam edin.
Peptit ayarları yapıldıktan sonra Geçiş Ayarları'na tıklayın. Filtre sekmesinin altında Öncül ücretleri 2 ve 3 olarak ayarlayın. İyon ücretlerini 1 olarak ayarlayın ve İyon türlerini y olarak ayarlayın.
Ürün iyonları kullanıcının seçimine bağlı olarak seçilebilir. Tüm parametreleri varsayılan olarak bırakın. Şimdi seçilen hedef proteinlerin katılım kimliklerini ekleyin.
Bu, Düzenle sekmesine tıklayıp Ekle'yi seçip son olarak katılım kimliklerini yapıştırarak yapılabilir. Kimlikler, arka plan proteomunda bulunan proteinlere ve daha önce belirlenen peptit ve geçiş ayarlarına göre oluşturulan bir geçiş listesine eşlenecektir. Bu geçiş listesini verin.
Enstrüman türü açılır menüsü seçeneğine tıklayarak doğru cihazın seçildiğini emin olun. Bu durumda, cihaz Thermo Altis'tir. Tanımlanmamış geçiş listesinde çok fazla geçiş olduğundan, liste başına yalnızca 350 geçiş sınırı tutun ve birden çok yöntem olarak dışa aktar.
İkili çözücü sistemi kullanılır. Solvent A %1 FA ve Solvent B %80 ACN'dir. Akış hızını dakikada 450 mikroliterde ve gösterildiği gibi degradede tutun.
Sütun bölmesi sıcaklığını 45 santigrat derece olarak ayarlayın. Sütun ve LC sistemi hakkında daha fazla bilgi için metne bakın. TSQ Altis'inizdeki MS ayarlarının burada gösterildiği gibi olduğundan emin olun.
Yeni bir yöntem oluşturmak için tek bir geçiş listesi alın. Dörtlü 1 ve dörtlü 3 çözünürlüğünü 7'de tutmanızı öneririz. Bunlar gerekirse daha da optimize edilebilir.
Çalıştırmalarda tutarlılık ve dolayısıyla veri kalitesini sağlamak için, çalışma sıranızı gösterildiği gibi hazırlayın. Birkaç boşlukla başlayın, boş karışımın bileşimi için metne bakın, ardından cihazın gün açısından tepkisindeki herhangi bir varyasyonu izlemek için bilinen konsantrasyonda bir QC standart ışık BSA'sı. QC'nin işi numunelerden hemen önce olmalı.
Sonra tüm örnekleri arada boşluklarla hizala. Enjeksiyon başına 25 ila 1 nanogram peptit oluşturan her numunenin eşit hacimlerini enjekte edin. İyileştirilmiş bir yöntem yapmak için, önce tanımlanmamış yöntemleri tüm örneklere karşı çalıştırın.
Sonuçları Skyline'a içe aktarın ve her peptidi manuel olarak kontrol edin. Her peptit için, tüm örneklerde sürekli olarak iyi zirveler gösteren bir öncü seçin. İyi zirveler göstermeyen öncülleri ve peptitleri silin.
Tüm zirvelere düzgün bir şekilde açıklama ekli olduğundan emin olun. Doğru tepe noktasını seçmek ve her öncül altındaki geçişleri daha da iyileştirmek için bir kitaplık kullanılabilir. Kitaplık, peptitler ve mevcut deneysel verilerin geçişleriyle eşleşen bir MS-MS spektral veri kümesidir.
DART P değerleri 1'e yakın olan tepeleri seçin ve kitaplıkla eşleşmeyen geçişleri kaldırın. DART P değeri, deneysel tepe ile kütüphane zirvesi arasındaki eşleşmenin ne kadar iyi olduğunu gösterir. Bir veya iki tur optimizasyondan sonra, rafine bir liste hazır olacaktır.
Bu rafine liste tek tek örnekler için çalıştırılabilir. Rafine çalıştırmaları Skyline'a içe aktarın ve tepelere düzgün bir şekilde açıklama ekleme. Belge kılavuzundaki her örneğe dikkatlice açıklama eklemek için Belge Ayarları altındaki Ek Açıklama sekmesini kullanın.
Denemenizin Koşul 1 ve Koşul 2 arasında karşılaştırmalar oluşturmak için Grup Karşılaştırma özelliğini kullanın. Bu, ayarlanmış P değerlerine sahip tablo ve iki grup arasında katlama değişim değerleri verecektir. Bilgimize göre, bu, insan beyin dokusu örneklerinde Apolipoprotein A-1, Vimentin ve Nikotinamid fosforibosyltransfeaz proteinleri için peptitleri tespit etmek için MRM kullanımını kullanan ilk çalışmadır.
LC gradyanı, durma süresi, çevrim süresi ve çarpışma enerjisi gibi çeşitli parametreleri optimize etmek, MRM deneyinin başarısını büyük ölçüde etkileyebilir. Bu tekniğin, farklı klinik koşullar ve hastalıkları ayırt etme yeteneğine sahip biyobelirteç kalıpları geliştirmek için kullanılabileceğini inanıyoruz.
