Целевые протеомные подходы быстро становятся методом выбора для проверки белков из краткосрочных экспериментов на основе протеомики или из экспериментов на основе молекулярной биологии. Мониторинг множественных реакций является одним из таких целевых подходов, который все чаще используется для обнаружения и количественной оценки белков из биологических образцов. В этом исследовании мы прошли через различные шаги, связанные с обнаружением и количественной оценкой белков из ткани мозга человека с целью познакомить читателей с основными требованиями эксперимента MRM.
Взвесьте около 50 мг мозговой ткани и промыть ткань 300 микролитрами 1x фосфатно-буферного физиологического раствора. Этот этап выполняется для удаления любой крови на внешней поверхности ткани, и, следовательно, желательно удалить как можно больше крови. После промывки PBS добавьте 300 микролитров лизисного буфера в трубку, содержащую ткань.
Разжижайте ткань с помощью зондового ультразвукового аппарата, сохраняя трубку на ледяной ванне. Продолжайте гомогенизацию тканей с помощью бисерного битерного битера, чтобы полностью лизезовать ткань. Центрифугируют содержимое пробирки при 6000 г в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию.
Переложите супернатант в свежий тюбик и однородно перемешайте. Возьмите небольшую аликвоту супернатанта и количественно оцените содержание белка с помощью стандартного анализа белка. Здесь мы покажем пример оценки белка с помощью bradford Assay.
Возьмите 50 микрограммов белка в микроцентрифужной трубке и уменьшите содержание, добавив TCEP таким образом, чтобы конечная концентрация была 20 миллимоляров. Инкубировать содержимое при 37 градусах в течение одного часа. После инкубации алкилируют восстановленные белки, добавляя йодоацетамид в трубку, так что конечная концентрация составляет 40 миллимоляров.
Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 минут. Теперь добавьте буфер В, чтобы в трубку в ней содержались восстановленные и алкилированные белки таким образом, чтобы конечная концентрация мочевины была меньше одного моляра. Добавьте трипсин в 1 до 30 ферментов в соотношении белок и инкубируют трубки в течение ночи при 37 градусах с постоянным встряхиванием.
После пищеварения сконцентрируйте переваренные пептиды в вакуумном концентраторе. На этом этапе пептиды могут быть либо восстановлены и обессолины, либо сохранены при минус 80 для будущего использования. Обессоливание, или пептидная очистка, имеет важное значение перед загрузкой образцов на любой LC-MS MS. Соли и другие загрязняющие вещества в образце могут засорять колонну и влиять на чувствительность прибора в долгосрочной перспективе.
Этот процесс может быть выполнен с использованием коммерчески доступных наконечников или столбцов C18 STAGE. Здесь мы изобразили рабочий процесс обессоливания пептидов с помощью наконечника C18 STAGE. После обессоливания высушите пептиды в вакуумном концентраторе.
Воссоздайте эти чистые пептиды и приступайте к количественной оценке с использованием метода Scopes. Для этого загрузите два микролитра образца в микрокапеточную пластину и рассчитайте концентрацию, как показано на слайде. Подготовка списка переходов является важным шагом в эксперименте SRM или MRM.
Список переходов содержит всю информацию, необходимую масс-спектрометру для мониторинга перехода. К ним относятся значения m by z ионов предшественников и продуктов, энергия столкновения перехода, полярность прибора и временной диапазон для сбора данных. Подготовьте список переходов с помощью Skyline.
Подготовьте фоновый протеом с помощью файла Human Proteome Fasta из UniProt и убедитесь, что он выбран на вкладке «Фон» настроек пептида. На вкладке Фильтр задайте минимальную длину 8 и максимальную длину 25. Продолжайте использовать настройки по умолчанию, если в пептидах нет других модификаций.
После того, как настройки пептидов были сделаны, нажмите «Настройки перехода». На вкладке Фильтр установите для параметра Сборы за прекурсоры значение 2 и 3. Установите ионные заряды как 1 и установите типы ионов в y.
Ионы продукта могут быть выбраны в зависимости от выбора пользователя. Оставьте все параметры по умолчанию. Теперь вставьте идентификаторы присоединения выбранных белков-мишеней.
Это можно сделать, нажав на вкладку «Правка», затем выбрав «Вставить» и, наконец, вставив идентификаторы присоединения. Идентификаторы будут сопоставлены с белками в фоновом протеоме и списком переходов, созданным на основе пептидных и переходных настроек, установленных ранее. Экспортируйте этот список переходов.
Убедитесь, что выбран правильный инструмент, щелкнув выпадающий список Тип инструмента. В данном случае инструментом является Thermo Altis. Поскольку неопределенный список переходов имеет слишком много переходов, оставить ограничение только в 350 переходов на список и экспортировать как несколько методов.
Используется бинарная система растворителей. Растворитель А составляет 1% FA, а растворитель B - 80% ACN. Держите скорость потока на уровне 450 микролитров в минуту и градиент, как показано на рисунке.
Установите температуру отсека колонны на уровне 45 градусов цельсия. Для получения более подробной информации о колонке и системе LC обратитесь к тексту. Убедитесь, что настройки MS в вашем TSQ Altis как показано здесь.
Импортируйте один список переходов, чтобы создать новый метод. Мы предлагаем сохранить разрешение для квадруполя 1 и квадруполя 3 на уровне 7. При необходимости они могут быть дополнительно оптимизированы.
Чтобы обеспечить согласованность выполнения и, следовательно, качество данных, подготовьте последовательность выполнения, как показано на рисунке. Начните с пары пробелов, обратитесь к тексту для состава пустой смеси, за которым следует стандартная лампа контроля качества BSA известной концентрации для мониторинга любых изменений в дневном отклике прибора. QC должен быть выполнен непосредственно перед образцами.
Затем выровняйте все образцы с заготовками между ними. Вводят равные объемы каждого образца, что составляет от 25 до 1 нанограмма пептидов за инъекцию. Чтобы создать усовершенствованный метод, сначала запустите неопределенные методы для целых образцов.
Импортируйте результаты в Skyline и вручную проверяйте каждый пептид. Для каждого пептида выберите один предшественник, показывающий неизменно хорошие пики во всех образцах. Удалите предшественники и пептиды, которые не показывают хороших пиков.
Убедитесь, что все пики правильно аннотированы. Для выбора правильного пика и дальнейшего уточнения переходов под каждым предшественником можно использовать библиотеку. Библиотека представляет собой набор спектральных данных MS-MS, сопоставленных с пептидами и переходами текущих экспериментальных данных.
Выберите пики, которые имеют значения DART P ближе к 1, и удалите переходы, которые не соответствуют библиотеке. Значение DART P обозначает, насколько хорошо соответствие между экспериментальным пиком и библиотечным пиком. После одного-двух раундов оптимизации будет готов уточненный список.
Этот уточненный список можно запустить для отдельных образцов. Импортируйте уточненные прогоны в Skyline и правильно аннотируйте пики. Вкладка Аннотация в разделе Параметры документа используется для тщательного аннотирования каждого образца в сетке документа.
Используйте функцию группового сравнения для создания сравнений между условием 1 и условием 2 эксперимента. Это даст таблицу с скорректированными значениями P и значениями изменения сгиба между двумя группами. Насколько нам известно, это первое исследование, использующего использование MRM для обнаружения пептидов для белков аполипопротеина A-1, виментина и никотинамидфосфорибозилтрансферазы в образцах тканей мозга человека.
Оптимизация различных параметров, таких как градиент LC, время ожидания, время цикла и энергия столкновения, может значительно повлиять на успех эксперимента с управлением записями сообщений. Мы считаем, что этот метод может быть использован для разработки паттернов биомаркеров со способностью различать различные клинические состояния и заболевания.
