Abordagens proteômicas direcionadas estão rapidamente se tornando o método de escolha para validação de proteínas de experimentos baseados em proteômica de curto prazo ou de experimentos baseados em biologia molecular. O monitoramento de múltiplas reações é uma dessas abordagens direcionadas que está sendo cada vez mais usada para detectar e quantificar proteínas de amostras biológicas. Neste estudo, percorremos as várias etapas envolvidas na detecção e quantificação de proteínas do tecido cerebral humano com a intenção de introduzir os leitores aos requisitos básicos de um experimento de MRM.
Pesar cerca de 50 mg de tecido cerebral, e lavar o tecido com 300 microliters de 1x salina tamponada com fosfato. Esta etapa é realizada para remover qualquer sangue na superfície externa do tecido e, portanto, é aconselhável remover o máximo de sangue possível. Após as lavagens com PBS, adicione 300 microliters de tampão de lise ao tubo contendo o tecido.
Lyse o tecido usando um sônico sonda enquanto mantém o tubo em um banho de gelo. Continue com a homogeneização do tecido usando um batedor de contas para lise completamente o tecido. Centrifugar o conteúdo do tubo a 6000 g por 15 minutos a quatro graus centígrados.
Transfira o supernante para um tubo fresco e misture de forma homogênea. Pegue uma pequena alíquota do supernasteante, e quantifique o teor de proteína usando um ensaio de proteína padrão. Aqui mostramos um exemplo de estimativa de proteína usando Bradford Assay.
Tome 50 microgramas de proteína em um tubo de microcentrifuuge e reduza o conteúdo adicionando TCEP de tal forma que a concentração final seja de 20 mililitros. Incubar o conteúdo a 37 graus por uma hora. Após a incubação, alquila as proteínas reduzidas adicionando iodoacetamida ao tubo, de tal forma que a concentração final seja de 40 mililitros.
Incubar o tubo no escuro por 30 minutos. Agora adicione buffer B ao tubo continha as proteínas reduzidas e alquiladas de tal forma que a concentração final de ureia é menor que um molar. Adicione trippsina em 1 quanto a 30% da relação enzima-proteína e incubar os tubos durante a noite a 37 graus com agitação constante.
Após a digestão, concentre os peptídeos digeridos em um concentrador de vácuo. Nesta etapa, os peptídeos podem ser reconstituídos e dessel ou armazenados a menos 80 para uso futuro. A desalagem, ou limpeza de peptídeos, é essencial antes de carregar as amostras em qualquer LC-MS MS. Sais e outros contaminantes na amostra podem entupir a coluna e afetar a sensibilidade do instrumento a longo prazo.
Este processo pode ser realizado utilizando dicas ou colunas C18 STAGE disponíveis comercialmente. Aqui nós mostramos o fluxo de trabalho para desalagem de peptídeos usando uma ponta C18 STAGE. Após a desalvação, seque os peptídeos em um concentrador de vácuo.
Reconstitua esses peptídeos limpos e proceda para quantificação usando o método Scopes. Para isso, carregue dois microlitadores da amostra em uma placa de microesque e calcule a concentração como mostrado no slide. A preparação da lista de transição é um passo crucial em um experimento srm ou mrm.
Uma lista de transição contém todas as informações exigidas pelo espectrômetro de massa para monitorar a transição. Isso inclui os valores m por z dos íons precursores e do produto, a energia de colisão da transição, a polaridade do instrumento e a faixa de tempo para aquisição de dados. Prepare a lista de transição usando Skyline.
Prepare um proteome de fundo usando o arquivo Human Proteome Fasta do UniProt e certifique-se de que ele seja selecionado na guia Fundo das Configurações de Peptídeos. Na guia Filtro, defina um comprimento mínimo de 8 e comprimento máximo de 25. Continue a usar as configurações padrão se não houver outras modificações nos peptídeos.
Uma vez que as configurações do peptídeo tenham sido feitas, clique em Configurações de transição. Na guia Filtro, defina as cargas Precursoras como 2 e 3. Defina as cargas de íons como 1 e defina os tipos de íons para y.
Os íons do produto podem ser selecionados dependendo da escolha do usuário. Deixe todos os parâmetros como padrão. Agora insira os IDs de adesão das proteínas-alvo selecionadas.
Isso pode ser feito clicando na guia Editar e selecionar Insert e, finalmente, colar os IDs de adesão. Os IDs serão mapeados para as proteínas no proteome de fundo e uma lista de transição criada com base nas configurações de peptídeo e transição definidas anteriormente. Exporte esta lista de transição.
Certifique-se de que o instrumento certo está selecionado clicando na opção de dropdown do tipo Instrumento. Neste caso, o instrumento é Thermo Altis. Uma vez que a lista de transição indefinida tem muitas transições, mantenha um limite de apenas 350 transições por lista e exporte como múltiplos métodos.
É usado um sistema de solvente binário. Solvente A é 1%FA e Solvente B é 80% ACN. Mantenha a vazão em 450 microliter por minuto e o gradiente como mostrado.
Coloque a temperatura do compartimento da coluna a 45 graus Celsius. Para obter mais detalhes sobre a coluna e o sistema LC, consulte o texto. Certifique-se de que as configurações de MS em seu TSQ Altis estão como mostrado aqui.
Importe uma única lista de transição para criar um novo método. Sugerimos manter a resolução para quadrupole 1 e quadrupole 3 às 7. Estes podem ser ainda mais otimizados, se necessário.
Para garantir a consistência nas corridas e, consequentemente, a qualidade dos dados, prepare sua sequência de execução como mostrado. Comece com um par de espaços em branco, consulte o texto para composição da mistura em branco, seguido por uma luz padrão QC BSA de concentração conhecida para monitorar qualquer variação na resposta diusó-dia do instrumento. O QC feito deve ser pouco antes das amostras.
Em seguida, alinhe todas as amostras com balas de feste de recolher no meio. Injete volumes iguais de cada amostra, representando 25 a 1 nanograma de peptídeos por injeção. Para fazer um método refinado, primeiro execute os métodos indefinidos contra amostras inteiras.
Importe os resultados no Skyline e verifique manualmente cada peptídeo. Para cada peptídeo, selecione um precursor mostrando picos consistentemente bons em todas as amostras. Exclua precursores e peptídeos que não estão mostrando bons picos.
Certifique-se de que todos os picos estão anotados corretamente. Para selecionar o pico certo e refinar ainda mais as transições sob cada precursor, uma biblioteca pode ser usada. Uma biblioteca é um conjunto de dados espectrais ms-MS combinados com peptídeos e transições dos dados experimentais atuais.
Escolha picos que tenham valores DART P mais próximos de 1 e remova transições que não correspondam à biblioteca. Um valor DART P denota o quão bom é o jogo entre o pico experimental e o pico da biblioteca. Após uma ou duas rodadas de otimização, uma lista refinada estará pronta.
Esta lista refinada pode ser executada para amostras individuais. Importe os refinados corre para skyline e anotar picos corretamente. Use a guia Anotação em Configurações de documento para anotar cada amostra na grade do documento cuidadosamente.
Use o recurso de comparação de grupo para criar comparações entre condição 1 e condição 2 do seu experimento. Isso dará tabela com valores P ajustados e valores de mudança de dobra entre os dois grupos. Pelo que sabemos, este é o primeiro estudo que utiliza o MRM para detectar peptídeos para as proteínas Apolipoprotein A-1, Vimentin e Nicotinamida phosphoribosyltransferase em amostras de tecido cerebral humano.
Otimizar vários parâmetros como gradiente de LC, tempo de moradia, tempo de ciclo e energia de colisão pode influenciar muito o sucesso de um experimento mrm. Acreditamos que essa técnica pode ser usada para desenvolver padrões de biomarcadores com capacidade de distinguir entre diferentes condições clínicas e doenças.
