有针对性的蛋白质方法正迅速成为短期蛋白质定性学实验或分子生物学实验中蛋白质验证的首选方法。多反应监测就是这样一种有针对性的方法，它正越来越多地用于检测和量化生物样本中的蛋白质。在这项研究中，我们走过了检测和量化人类脑组织蛋白质的各种步骤，目的是向读者介绍MM实验的基本要求。
重约50毫克的脑组织，用300微升1倍磷酸盐缓冲盐水清洗组织。此步骤执行是为了去除组织外部表面的任何血液，因此建议尽可能多地去除血液。用 PBS 洗涤后，在含有组织的管子中加入 300 微升裂解缓冲器。
使用探针声波器对组织进行莱塞，同时将管子放在冰浴上。继续使用珠子搅拌器进行组织均质化，以完全解合组织。在 4 摄氏度下将管子内的含量离心 6000 g，15 分钟。
将超高纳特转移到新鲜的管子中，并同质混合。取一小片超高分子，然后使用标准蛋白质检测对蛋白质含量进行量化。在这里，我们展示了一个使用布拉德福德检测蛋白质估计的例子。
在微中心管中加入50微克蛋白质，通过添加TCEP来减少其含量，使最终浓度达到20毫摩尔。将内容在 37 度下孵化一小时。孵化后，通过在管中加入碘酰胺来减少蛋白质的含量，最终浓度为40毫摩尔。
在黑暗中孵育管子30分钟。现在添加缓冲B到管包含减少和烷基化蛋白质，使尿素的最终浓度小于一个摩尔。将试丁酶添加到30酶与蛋白质的比例中，在37度下在夜间孵育管子，持续摇晃。
消化后，将消化的肽浓缩在真空浓缩器中。在此步骤中，肽可以重组和脱盐，也可以储存在负 80 以供将来使用。脱盐或肽清理在将样品加载到任何 LC-MS MS 上之前至关重要。从长远来看，样品中的盐和其他污染物会堵塞柱子并影响仪器的灵敏度。
此过程可以使用市售的 C18 STAGE 提示或列执行。在这里，我们用C18舞台提示描绘了肽脱盐的工作流程。脱盐后，在真空浓缩器中干燥肽。
重组这些清洁肽，然后使用示波器方法进行量化。为此，将样品的两个微升加载到微滴板中，并计算幻灯片中显示的浓度。过渡列表准备是 SRM 或 MRM 实验的关键步骤。
过渡列表包含质谱仪监控过渡所需的所有信息。这包括前体和产品离子的 m 按 z 值、过渡的碰撞能量、仪器的极性以及数据采集的时间范围。使用天际线准备过渡列表。
使用 UniProt 中的人类蛋白质组 Fasta 文件准备背景蛋白质组，并确保它在肽设置的背景选项卡下进行选择。在"过滤器"选项卡中，设置最小长度为 8，最大长度为 25。如果肽中没有其他修改，请继续使用默认设置。
一旦制作了肽设置，请单击"过渡设置"。在"过滤器"选项卡下，将前体电荷设置为 2 和 3。将离子电荷设置为 1，并将离子类型设置为 y。
产品离子可根据用户的选择进行选择。将所有参数保留为默认值。现在插入选定目标蛋白的加入 ID。
这可以通过单击"编辑"选项卡，然后选择"插入"并最终粘贴加入 ID 来完成。ID 将映射到后台蛋白质组中的蛋白质，以及根据之前设置的肽和过渡设置创建的过渡列表。导出此过渡列表。
通过单击"仪器类型"下拉选项，确保选择正确的工具。在这种情况下，仪器是热阿尔蒂斯。由于未定义的过渡列表具有太多的过渡，因此每个列表仅保留 350 个过渡限制，并作为多种方法进行导出。
使用二元溶剂系统。溶剂 A 为 1%FA，溶剂 B 为 80%ACN。将流速保持在每分钟 450 微升，并按如图所示保持梯度。
将柱室温度设置为 45 摄氏度。有关列和 LC 系统的更多详细信息，请参阅文本。请确保 TSQ Altis 中的 MS 设置如图所示。
导入单个过渡列表以创建新方法。我们建议将四倍体 1 和四卢比 3 的分辨率保持在 7。如果需要，可以进一步优化这些优化。
要确保运行中的一致性，从而确保数据质量，请按照所示准备运行序列。从几个空白开始，参考文本来合成空白混合物，然后是已知浓度的QC标准光 BSA，以监测仪器日常响应的任何变化。QC 完成应就在样品之前。
接下来，将所有样品排起来，中间有空白。每个样品的注射量相等，每次注射25至1毫微克肽。要制作精制方法，首先对整个样品运行未定义的方法。
将结果导入天际线并手动检查每种肽。对于每个肽，选择一个前体，显示所有样品中始终如一的良好峰值。删除未显示良好峰值的前体和肽。
确保所有峰值都正确注释。要选择正确的峰值并进一步完善每个前体下的过渡，可以使用库。库是一组 MS-MS 光谱数据，与肽和当前实验数据的过渡相匹配。
选择具有 DART P 值接近 1 的峰值，并删除与库不匹配的过渡。DART P 值表示实验峰值和库峰之间的匹配程度。经过一两轮优化后，将准备好一份精致的列表。
此精制列表可用于单个示例。将精炼的运行导入天际线，并正确注释峰值。使用文档设置下的注释选项卡仔细注释文档网格中的每个示例。
使用组比较功能在实验的条件 1 和条件 2 之间创建比较。这将提供调整后的 P 值的表，并在两组之间折叠更改值。据我们所知，这是首次利用MM检测人体脑组织样本中阿波利波蛋白A-1、维门汀和尼古丁胺磷酸转移酶的肽的研究。
优化LC梯度、停留时间、周期时间和碰撞能量等各种参数，可以极大地影响MM实验的成功。我们相信，这项技术可以用来开发生物标志物模式，能够区分不同的临床条件和疾病。
