이 프로토콜은 유도 된 다능성 줄기 세포를 사용하여 인간 심혈관 세포 유형을 생성하는 힘과 72 시간 이내에 박동 심장 스페로이드를 생성하는 다목적 기술을 결합합니다. 이 심장 스페로이드는 질병 모델링 및 약물 검사에 사용될 수 있습니다. 이 촉진 기법의 주요 장점 중 하나는 하나는 거의 생성 할 수 있다는 것입니다 1000 표준 12 웰 플레이트에서 심장 스페로이드를 치고.
그리고 가장 중요한 것은, 각각의 모든 심장 스페로이드는 화상 진찰 기지를 둔 기술을 사용하여 그것의 수축 기능에 관하여 분석될 수 있습니다. 전자 레인지에 아가로즈를 녹인 후 생물 안전 캐비닛에 넣고 3 분 동안 식힙니다. 용융 아가로즈의 파이펫 700 마이크로리터는 9개 배열의 실리콘 마이크로몰드에 추가하여 거품을 일으키지 않도록 주의를 기울입니다.
조심스럽게 아가로즈 지속 시간을 가속화하기 위해 미리 차가운 얼음 블록에 금형을 배치합니다. 아가로즈가 반투명해지면, 미세 몰드의 가장자리를 조심스럽게 구부려 아가로즈 복제본을 잃어내고 실리콘 마이크로몰드에서 분리하기 위해 모든 면에서 복제본을 부드럽게 벗깁니다. 멸균 12웰 플레이트에 81개의 원형 오목이 들어 있는 아가로즈 미세 조직 트레이를 전달한 다음, 아가로즈 마이크로티슈 트레이에 PBS 2밀리리터를 넣고, 갇힌 기포 나 불규칙하게 생긴 우물에 대한 현미경으로 검사한다.
아가로즈 트레이를 하룻밤 사이에 70%에탄올의 2밀리리터에 담그고, 그 다음에 는 생물안전 캐비닛에서 1시간 동안 UV 처리를 합니다. 70%에탄올을 제거하고 증류수로 두 번, PBS 2밀리리터로 한 번 씻으시면 됩니다. 유도된 다능성 줄기 세포가 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포가 트립시화 및 중화 후에 계산되면, 세포 현탁액을 얼음 위에 놓는다.
새로운 튜브에서 유도된 다능성 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 혼합한다. 이어서, 오목한 후, 우물및 세포 시딩 챔버로부터 PBS를 제거하고, 셀 서스펜션의 마이크로리터 200개를 드롭방향으로 추가한다. 세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 2시간 동안 정착하도록 허용합니다.
아가로즈 몰드를 둘러싼 마이크로 조직 제조 배지를 추가하여 내부 챔버의 표면을 덮습니다. 24시간 후 원형 오목에서 자체 조립 및 컴팩트한 스페로이드를 관찰하십시오. 스페로이드를 유지하기 위해 매2일마다 배지를 변경합니다.
전형적으로, 48시간 후에, 스페로이드의 자발적인 구타를 관찰할 수 있다. 지하 막 매트릭스 배지 또는 젤라틴 코팅 챔버 슬라이드에 개별 세포 유형을 별도로 배양한다. 부드럽게 원형 오목에서 심장 미세 조직을 플러시하고, 15 밀리리터 연대기 튜브에서 수집합니다.
중간 을 흡인 하 고 세포 또는 마이크로 조직을 헹구고, PBS의 1 밀리 리터와 함께. 그런 다음 세포 또는 마이크로 조직을 4.2%PFA를 포함하는 고정 버퍼로 고정하고 실온에서 배양합니다. PFA를 흡인하고 세포 또는 미세 조직을 침투 용액의 1 밀리리터로 배양합니다.
그런 다음 용액을 흡인하고 PBS의 2 ~3 밀리리터로 헹구세요. 500~1000마이크로리터의 차단 용액을 세포에 추가하고 챔버 슬라이드를 위해 적어도 1시간 동안 배양하고, 마이크로티티슈의 경우 3~4시간 동안 배양한다. 챔버 슬라이드에 대한 1 시간 동안 차단 용액에 공액 항체와 샘플을 배양하고, 심장 미세 조직을위한 섭씨 4도에서 하룻밤.
챔버 슬라이드를 0.1%Tween 20의 500 마이크로리터로 세 번 세척한 다음, 각 세척 사이에 5분 동안 지속된 다음 PBS로 최종 세척을 수행합니다. 심장 마이크로 조직을 0.1%Tween 20의 2밀리리터로 5회 세척하고, 각 세척 사이에 20분의 지속 시간을 갖는다. 그런 다음 20 분 동안 최종 세척을 수행하십시오.
공초점 현미경 검사전에 DAPI로 세포 또는 마이크로 조직을 배양한 다음 심장 미세 조직을 35mm 유리 바닥 접시로 조심스럽게 옮기고 PBS를 추가하여 미세 조직을 침수합니다. 15 밀리리터 만성 튜브에 넓은 또는 1 밀리 리터 파이펫 팁을 사용하여 중간 하나와 원형 오목에서 마이크로 티슈를 플러시하고, 정착 할 수 있도록. 그런 다음, 매체를 흡인하고 1 밀리리터 PBS로 헹구세요.
효소 소화 완충제 200~300마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 미세 조직을 1 분 동안 부드럽게 섞고 인큐베이션을 반복합니다. 인큐베이션 후, 마이크로티티를 일반 1밀리리터 파이펫 팁과 격렬하게 섞어 단일 세포로 소화합니다.
탁탁세포 현탁액을 획득하고, 5%의 FBS를 함유한 5밀리리터의 세포 현탁액을 즉시 중화한다. 40 마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 변형시키고 총 세포 수를 계산합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 G에서 단일 셀 서스펜션을 분리합니다.
FITC 부속서 V 및 프로피듐 요오드, 또는 TO-PRO-3 죽은 세포 배제 염료로 부속 결합 버퍼에서 셀을 흡인하고 재침표하고 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 감산 형결력 버퍼의 300 마이크로리터를 세포 현탁액에 추가하고 유동 세포 측정 분석을 위해 원형 하단 FACS 튜브로 전송한다. 정제유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 내피세포 및 심장 섬유아세포는 위상 대비 현미경을 사용하여 시각화하였다.
상이한 세포 유형의 순도는 면역 염색 및 유동 세포측정을 사용하여 결정되었다. 트로포닌 T는 심근세포에 대한 마커로 사용되었고, 90% 이상의 순도가 달성되었다. 혈소판 내피 세포 접착 분자 CD31 및 바이멘틴은 내피 세포 및 심장 섬유아세포에 대한 마커로 사용되었으며, 각각 98 및 96% 이상의 순도를 나타냈다.
면역형광 염색은 심근세포가 가장 무겁고 미세 조직의 중심을 점유했다는 것을 밝혔으며, 내피 세포는 미세 조직 전체에 흩어져 있었고, 심장 섬유아세포는 주로 주변을 점유했다. 이 속도 1 및 Liberase TL을 사용하여 마이크로 조직의 소화는 배양에서 2 주 후에 더 적은 세포세포로 높게 실행 가능한 세포 비율 귀착되었습니다. 독소루비신 유도 용량 의존 심장 독성의 높은 농도에 심장 미세 조직의 1 시간 노출.
마이크로 조직 수축, 벡터 운동은 미세 조직 전반에 걸쳐 평균 수축 프로파일을 나타내는 의사 열지도를 생성하였다. 심장 미세 조직의 수축 운동은 수축 속도, 이완 속도 및 두 수축 주기 사이의 시간으로 계산된 박동 속도로 측정된 양수 피크를 생성했습니다. 심장 미세 조직의 수축은 문화권에서 4 주 이상 일관되었습니다.
세포 가열은 이 특정 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 마이크로웰 내에서균분포를 위해 세포 현탁액을 아가로즈 어레이로 조심스럽게 분배하고 오버플로를 방지해야 합니다. 이러한 미세 조직의 최적화된 방사선 프로토콜을 사용하여, 이들 중 하나는 다이목다른 치료 조건으로 인해 세포 특이적 유전자 발현 패턴을 이해하기 위해 단세포 RNA-seq 또는 단일 세포 ATAC-seq와 같은 높은 처리량 시퀀싱 기술을 적용할 수 있다.
