Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreler ve 72 saatten daha kısa bir sürede dövülen kardiyak sferoidler üretmek için çok yönlü bir teknik kullanarak insan kardiyovasküler hücre tipleri üretme gücünü birleştirir. Bu kardiyak sferoidler hastalık modelleme ve ilaç testi için kullanılabilir. Bu facile tekniğinin ana avantajlarından biri, standart bir 12 kuyu plakasında yaklaşık 1000 atan kardiyak sferoid üretebilmemizdir.
Ve en önemlisi, her kardiyak sferoid görüntüleme tabanlı teknik kullanılarak kontrtil fonksiyonu için test edilebilir. Mikrodalgada agarose eritdikten sonra biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve üç dakika soğumasını bekleyin. Pipet 700 mikrolitre erimiş agarose ve kabarcıklar üretmekten kaçınmaya özen, dokuza dokuz dizi silikon mikromold ekleyin.
Agarose süresini hızlandırmak için kalıbı soğuk öncesi buz bloğuna dikkatlice yerleştirin. Agarose yarı saydam hale geldiğinde, agarose replikasını kaybetmek için mikromold kenarlarını dikkatlice bükün ve silikon mikromolddan ayırmak için replikayı her taraftan nazikçe soyun. 81 dairesel girinti içeren agarose mikrotissue tepsisini steril 12 kuyulu bir tabağa aktarın, ardından agarose mikrotissue tepsisine iki mililitre PBS ekleyin ve mikroskop altında sıkışmış kabarcıklar veya düzensiz şekilli kuyular için inceleyin.
Agarose tepsisini bir gecede iki mililitre% 70 etanol içine batırın, ardından biyogüvenlik kabininde bir saat boyunca UV tedavisi. % 70 etanolünü çıkarın ve damıtılmış suyla iki kez ve bir kez iki mililitre PBS ile yıkayın. İndüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücreleri trypsinasyon ve nötralizasyondan sonra sayıldıktan sonra, hücre süspansiyonlarını buza yerleştirin.
Yeni bir tüpte, indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositleri, kardiyak fibroblastları ve endotel hücrelerini karıştırın. Ardından, PBS'yi girintilere dokunmadan kuyudan ve hücre tohumlama odasından çıkarın ve hücre süspansiyonunun damla yönünde 200 mikrolitresini ekleyin. Hücrelerin iki saat boyunca bir karbondioksit inkübatörüne 37 santigrat derecede yerleşmesine izin verin.
İç odanın yüzeyini kaplamak için agarose kalıbını çevreleyen mikro doku imalat ortamını ekleyin. 24 saat sonra, dairesel girintilerde kendi kendine monte edilmiş ve kompakt küreseller için gözlemleyin. Küreselleri korumak için ortamı her iki günde bir değiştirin.
Tipik olarak, 48 saat sonra, sferoidlerin kendiliğinden darp edilmesi gözlenebilir. Bodrum membran matris ortamında veya jelatin kaplı oda slaytlarında tek tek hücre tiplerini ayrı ayrı kültürleyin. Kardiyak mikrotissues'i dairesel girintilerden hafifçe boşaltın ve 15 mililitrelik bir kronik tüpte toplayın.
Ortamı emiş edin ve hücreleri veya mikrotizeleri bir mililitre PBS ile durulayın. Ardından, hücreleri veya mikrotissuları% 4.2 PFA içeren sabitleme tamponu ile sabitlayın ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. PFA'yı epire edin ve hücreleri veya mikrotize edicileri bir mililitre permeabilizasyon çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.
Ardından, çözeltiyi epire edin ve iki ila üç mililitre PBS ile durulayın. Hücrelere 500 ila 1000 mikrolitre blokaj çözeltisi ekleyin ve oda slaytları için en az bir saat ve mikrotissues için üç ila dört saat kuluçkaya yatırın. Numuneleri, oda slaytları için bir saat boyunca ve kardiyak mikrotissular için dört santigrat derecede bir gecede blokaj çözeltisinde konjuge antikorlarla kuluçkaya yatırın.
Oda slaytlarını her yıkama arasında beş dakikalık sürelerle 0,1% 20'lik 500 mikrolitre ile üç kez yıkayın, ardından PBS ile son bir yıkama gerçekleştirin. Kardiyak mikro dokuları beş kez iki mililitre ile yıkayın 0.1% Ara 20, her yıkama arasında 20 dakikalık bir süre ile. Ardından, 20 dakika daha son bir yıkama yapın.
Konfokal mikroskopiden önce hücreleri veya mikrotizeleri DAPI ile kuluçkaya yatırın, ardından kardiyak mikrotizeleri dikkatlice 35 milimetrelik bir cam alt tabağa aktarın ve mikrotissueyi batırmak için PBS ekleyin. Mikrotissues geniş veya bir mililitre pipet ucu kullanarak orta ile dairesel girintiler dışarı 15 mililitre kronik tüp içine yıkayın ve yerleşmek için izin verin. Ardından, ortamı epire edin ve bir mililitre PBS ile durulayın.
Enzim sindirim tamponunun 200 ila 300 mikrolitresini ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra mikrotissues bir dakika boyunca hafifçe karıştırın ve inkübasyonu tekrarlayın. Kuluçkadan sonra, mikrotissues'i tek bir hücreye sindirmek için normal bir mililitre pipet ucuyla kuvvetlice karıştırın.
Bulanık bir hücre süspansiyonu elde edin ve hücre süspansiyonu derhal%5 FBS içeren beş mililitre orta ile nötralize edin. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre hücre süzgecinden geçirin ve toplam hücre sayısını sayın. Tek hücreli süspansiyonu 300 kez G'de 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatantı epire edin ve EKNİk Bağlama tamponundaki hücreleri FITC Annexin V ve propidium iyodür veya TO-PRO-3 ölü hücre dışlama boyası ile yeniden biriktirin ve buzda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonu için eksel bağlama tamponunun 300 mikrolitresini ekleyin ve akış sitometri analizi için yuvarlak bir alt FACS tüpüne aktarın. Saflaştırılmış indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, endotel hücreleri ve kardiyak fibroblastlar faz kontrastlı mikroskopi kullanılarak görselleştirildi.
İmmün boyama ve akış sitometrisi kullanılarak farklı hücre tiplerinin saflığı belirlendi. Troponin T kardiyomiyositler için bir belirteç olarak kullanıldı ve% 90'ın üzerinde saflık elde edildi. Trombosit endotel hücre yapışma molekülü CD31 ve vimentin endotel hücreleri ve kardiyak fibroblastlar için belirteç olarak kullanıldı ve sırasıyla% 98 ve 96 üzerinde saflık gösterdi.
İmmünofluoresans lekeleme, kardiyomiyositlerin en ağır olduğunu ve mikrotissuların merkezini işgal ettiğini, endotel hücrelerinin ise mikrotizeler boyunca serpiştirildiğini ve kardiyak fibroblastların ağırlıklı olarak çevreyi işgal ettiğini ortaya koydu. Bu tempo bir ve Liberase TL kullanan mikrotissuların sindirimi, kültürde iki hafta sonra daha az apoptotik hücre ile yüksek oranda canlı hücre oranlarına neden oldu. Kardiyak mikrotissuların bir saatlik maruziyeti, doksrubisin indüklenen doz bağımlı kardiyotoksisinin yüksek konsantrasyonuna maruz kalmasıdır.
Mikro dokuların kontraktisitesi ve vektör hareketi, mikrotissue genelinde ortalama kasılma profilini gösteren sahte bir ısı haritası oluşturdu. Kardiyak mikrotizelerin kontrtil hareketi, iki kasılma döngüsü arasındaki zaman olarak hesaplanan kasılma hızı, gevşeme hızı ve beat hızı olarak ölçülen pozitif zirveler üretti. Kardiyak mikrotissuların kontrtinaklığı kültürde dört hafta boyunca tutarlıydı.
Hücrelerin ısıtılması, mikrowells içinde eşit dağıtım için hücre süspansiyonunun agarose dizisine damla yönünde dikkatlice dağıtılmasına ve taşmasını önlemeye dikkat etmek gereken bu özel protokoldeki en önemli adımlardan biridir. Bu mikrotizelerin optimize edilmiş radyasyon protokolünü kullanarak, farklı tedavi koşulları nedeniyle ortaya çıkan hücreye özgü gen ekspresyon kalıplarını anlamak için bunları tek hücreli RNA-seq veya tek hücreli ATAC-seq gibi yüksek verimli sıralama teknolojilerine tabi tutulabilir.
