O protocolo combina o poder de gerar tipos de células cardiovasculares humanas usando células-tronco pluripotentes induzidas e uma técnica versátil para gerar esferoides cardíacos em menos de 72 horas. Estes esferoides cardíacos podem ser usados para modelagem de doenças e testes de drogas. Uma das principais vantagens desta técnica fácil é que se poderia gerar quase 1000 esferoides cardíacos batendo em uma placa padrão de 12 poços.
E o mais importante, cada esferoide cardíaco pode ser testado para sua função contratil usando técnica baseada em imagem. Depois de derreter surgiu no micro-ondas, coloque-o no armário de biossegurança e deixe esfriar por três minutos. Pipeta 700 microliters da agarose derretida e adicioná-lo ao micromold de silicone de uma matriz de nove por nove, tomando cuidado para evitar gerar bolhas.
Coloque cuidadosamente o molde no bloco de gelo pré-frio para acelerar a duração da agarose. Uma vez que a agarose se torne translúcida, dobre cuidadosamente as bordas do micromold para losen a réplica agarose e retire suavemente a réplica de todos os lados para desvincula-la do micromold de silicone. Transfira a bandeja de microtissue agarose contendo 81 recessos circulares em uma placa estéril de 12 poços, em seguida, adicione dois mililitros de PBS à bandeja de microtissue agarose, e inspecione-a sob o microscópio para quaisquer bolhas presas ou poços de forma irregular.
Submergir a bandeja de agarose em dois mililitros de 70% de etanol durante a noite, seguido pelo tratamento UV no armário de biossegurança por uma hora. Retire o 70% do etanol e lave duas vezes com água destilada, e uma vez com dois mililitros de PBS. Uma vez que os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais são contados após a tentação e neutralização, coloque as suspensões celulares no gelo.
Em um novo tubo, misture os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos, fibroblastos cardíacos e células endoteliais. Em seguida, remova o PBS do poço e da câmara de semeadura celular sem tocar nos recessos e adicione 200 microliters da suspensão celular dropwise. Permita que as células se instalem a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono por duas horas.
Adicione o meio de fabricação de micro tecidos ao redor do molde de agarose para cobrir a superfície da câmara interna. Após 24 horas, observe para esferoides auto-montados e compactos nos recessos circulares. Troque o meio a cada dois dias para manter os esferoides.
Normalmente, após 48 horas, pode-se observar espancamento espontâneo dos esferoides. Cultume os tipos de células individuais separadamente no meio da matriz da membrana do porão, ou slides de câmara revestidos de gelatina. Tire suavemente os microtissues cardíacos dos recessos circulares, e colete-os em um tubo de crônica de 15 mililitros.
Aspire o meio e enxágue as células ou os microtissues, com um mililitro de PBS. Em seguida, fixar as células ou os microtissues com tampão de fixação contendo 4,2% pfa e incubar à temperatura ambiente. Aspire o PFA e incuba as células ou os microtissues com um mililitro de solução permeabilizante.
Em seguida, aspire a solução e enxágue com dois a três mililitros de PBS. Adicione 500 a 1000 microliters de solução de bloqueio às células e incubar por pelo menos uma hora para os slides da câmara, e por três a quatro horas para os microtissues. Incubar as amostras com anticorpos conjugados na solução de bloqueio por uma hora para os slides da câmara, e durante a noite a quatro graus Celsius para os microtissues cardíacos.
Lave os slides da câmara três vezes com 500 microlitres de 0,1%Tween 20, com cinco minutos de duração entre cada lavagem, em seguida, realize uma lavagem final com PBS. Lave os micro tecidos cardíacos cinco vezes com dois mililitros de 0,1%Tween 20, com uma duração de 20 minutos entre cada lavagem. Em seguida, faça uma lavagem final por mais 20 minutos.
Incubar as células ou os microtissues com DAPI antes da microscopia confocal, em seguida, transfira cuidadosamente os microtissues cardíacos para um prato de fundo de vidro de 35 milímetros, e adicione PBS para submergir o microtissue. Tire os microtissues dos recessos circulares com um médio usando uma ponta de pipeta larga ou mililitro em um tubo crônico de 15 mililitros, e permita que eles se instalem. Em seguida, aspire o meio e enxágue com um mililitro PBS.
Adicione 200 a 300 microliters do tampão de digestão da enzima e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, misture os microtissues suavemente por um minuto e repita a incubação. Após a incubação, misture os microtissues vigorosamente com uma ponta de pipeta de um mililitro regular para digeri-la em células únicas.
Obtenha uma suspensão de célula turva e neutralize imediatamente a suspensão celular com cinco mililitros de meio contendo 5%FBS. Coe a suspensão celular através de um coador de células de 40 micrômetros, e conte o número total de células. Centrifugar a suspensão unicelular a 300 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Aspire o supernatante e resuspenque as células em tampão de ligação anexo com fitc anexo V e iodeto de propidium, ou corante de exclusão de células mortas TO-PRO-3, e incubar por 10 minutos no gelo. Após a incubação, adicione 300 microliters do tampão de ligação de anexação à suspensão celular e transfira-o para um tubo FACS fundo redondo para análise de citometria de fluxo. Cardiomiócitos pluripotentes pluripotentes induzidos, células endoteliais e fibroblastos cardíacos foram visualizados por meio de microscopia de contraste de fase.
A pureza de diferentes tipos celulares foi determinada por meio da coloração imuno e citometria de fluxo. Troponina T foi usada como marcador para cardiomiócitos, e mais de 90% de pureza foi alcançada. A molécula de adesão celular endotelial plaquetária CD31 e vimentina foram utilizadas como marcadores para células endoteliais e fibroblastos cardíacos, e indicaram pureza acima de 98 e 96%, respectivamente.
A coloração da imunofluorescência revelou que os cardiomiócitos eram os mais pesados e ocupavam o centro das microtissues, enquanto as células endoteliais eram intercaladas ao longo dos microtissuos, e os fibroblastos cardíacos ocupavam predominantemente a periferia. A digestão das microtissues usando este ritmo e liberase TL resultou em proporções celulares altamente viáveis com menos células apoptóticas após duas semanas de cultura. A exposição de uma hora dos microtissues cardíacos a uma alta concentração de doxorubicina induzida dose de cardiotoxicidade dependente.
A contratude dos micro tecidos, e o movimento dos vetores geraram um pseudo mapa de calor que ilustrava o perfil médio de contração através do microtissue. O movimento contratil das microtissues cardíacas gerou picos positivos que foram medidos como a velocidade de contração, a velocidade de relaxamento e a taxa de batida, que foi calculada como o tempo entre dois ciclos de contração. A contratilidade das microtissues cardíacas foi consistente ao longo de quatro semanas na cultura.
O aquecimento das células é um dos passos mais importantes deste protocolo em particular, onde deve-se tomar cuidado para dispensar cuidadosamente a suspensão da célula dropwise na matriz de agarose para distribuição uniforme dentro dos microwells, e para evitar o transbordamento. Usando o protocolo de radiação otimizado desses microtissues, pode-se sujeitar-os a tecnologias de sequenciamento de alto rendimento, como RNA-seq de células únicas ou ATAC-seq de células únicas para entender padrões específicos de expressão genética celular resultantes de diferentes condições de tratamento.
