ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולאפיין אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות ביציות. יישמנו מיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי להעריך הצטברות כתבים לאורך כל התבגרות ביצית במבחנה. פעולה זו מאתרת במדויק את הזמן שבו הפעלה או דיכוי תרגום מתרחש במהלך התבגרות ביצית.
כדי להתחיל, בזהירות לפתוח את זקיקי antral על ידי ביצוע חתך קטן בקיר הזקיק עם מחט 26 מד. לבודד COCs שלמים עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטה זכוכית המופעלת בפה. השתמש פיפטה קטנה יותר מכנית denude COCs על ידי pipetting חוזר.
שואפים את ביציות denuded ומניחים אותם בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת מיקרומולאר אחד של cilostamide. מניחים את המנה באינקובטור במשך שעתיים כדי לאפשר ביציות להתאושש מן הלחץ המושרה על ידי בידודם מן הזקיקים. מניחים צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ במשיכה מכנית להכנת מחטי הזרקה.
לכופף את קצה המחט בזווית של 45 מעלות באמצעות חוט מחומם להזרקה אופטימלית. מניחים 20 טיפות מיקרוליטר של מדיום איסוף ביציות בסיסי בצלחת פוליסטירן, ומכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל. הכינו נפח גדול יותר של תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם למיקרוליטר של Ypet UTR ו- mCherry כל אחד.
לאחסן aliquots של אלה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה, צנטריפוגה aliquot במשך שתי דקות ב 20, 000 פעמים G, ולאחר מכן להעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוגה חדש. לטעון את מחט ההזרקה עם כ 0.5 microliters של תערובת כתב.
מניחים את פיפטה מחזיק ואת מחט ההזרקה למחזיקים ומניחים אותם טיפה של מדיום אוסף ביצית. פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה בעדינות על זה נגד פיפטה מחזיק. מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי ומזריקים חמישה עד עשרה פיקוליטרים של תערובת הכתבים.
דגירה ביציות ואת מדיום התבגרות עם cilostamide מיקרומולאר אחד במשך 16 שעות כדי לאפשר את אות mCherry לרמה. למיקרוסקופיה של זמן לשגות, להכין צלחת פטרי עם שתי טיפות 20 מיקרוליטר של מדיום התבגרות עבור כל כתב מוזרק, טיפה אחת עם cilostamide מיקרומולארי אחד עבור שליטה פרופה אני נעצר ביציות, טיפה אחת ללא cilostamide עבור התבגרות ביציות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל ומניחים אותן באינקובטור.
לאחר הדגירה המוקדמת, להסיר את ביציות מוזרק מן האינקובטור ולשטוף אותם ארבע פעמים במדיום התבגרות ללא cilostamide. שמור כמה ביציות במדיום התבגרות עם cilostamide מיקרומולאר אחד כקבוצת ביקורת prophase אני ביצית. מעבירים את ביציות מוזרק טיפות בהתאמה שלהם על צלחת מיקרוסקופ זמן לשגות שהוכן בעבר.
Cluster את ביציות עם פיפטה זכוכית סגורה כדי למנוע את תנועתם במהלך ההקלטה. מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ המצוידת במערכת חיסול דיודה פולטת אור ובשלב ממונע המצויד בתא סביבתי המתוחזק ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני, תוך שימוש בפרמטרים המוזכרים בכתב היד. הזן את ההגדרות המתאימות לניסוי זמן לשגות על ידי לחיצה על יישומים ולאחר מכן רכישה רב ממדית.
בחר את הכרטיסיה הראשית הראשונה ובחר זמן לשגות, מיקומי שלבים מרובים ואורך גל מרובים. בחר את הכרטיסיה שמירה כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי. לאחר מכן בחר את הכרטיסיה זמן לשגות כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן.
בחר את שלב הכרטיסיה, הפעל את brightfield ואתר את מיקום ביציות על-ידי פתיחת חלון חדש ובחירה באפשרות רכוש, רכוש והצג בשידור חי. לאחר איתור ביציות, חזור לחלון הרכישה הרב-ממדי ולחץ על הפלוס כדי להגדיר את מיקום ביציות. בחר את אורכי הגל של הכרטיסיה והגדר שלושה אורכי גל שונים עבור brightfield, YFP ו- mCherry.
התאם את החשיפה עבור Ypet ו- mCherry ולאחר מכן התחל את ניסוי הזמן-לשגות על-ידי לחיצה על רכישה. לניתוח של Ypet שלושה תרגום UTR הממשלה, לבצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית, ביצית עצמה על ידי לחיצה על אזור אליפסה, ואזור קטן המקיף את ביצית לשמש חיסור רקע על ידי לחיצה על אזור מלבני. יצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על פתח יומן רישום ולאחר מכן רשום נתונים.
עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחת את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור ביצית בנפרד עבור אורכי גל של YFP ו- mCherry. הביטוי של mCherry ו- YFP בתעמולה I וביצית התבגרות נרשם ב -39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ותשעה נעצרו ב prophase אני כשליטה שלילית. יחסי YFP ל- mCherry בודדים עבור אותות של פרופאז I-נעצר וביצית התבגרות תוקנו עבור נפח מוזרק על ידי חלוקת אות YFP על ידי האות mCherry הממוצע של 10 נקודות הזמן האחרונות עבור פצצה אני נעצר והתבגרות ביציות.
שיעורי התרגום של הכתב YFP נמדדו על ידי עקומה התאמת YFP כדי mCherry היחסים prophase אני ב התבגרות ביציות במהלך האפס הראשון עד שעתיים, או שמונה עד 10 שעות לאחר שחרור cilostamide באמצעות רגרסיה ליניארית. הצטברות הכתב אינה עוקבת אחר דפוס ליניארי, כפי שצוין על ידי הבדל משמעותי בשיעורי התרגום בין אפס לשעתיים ושמונה עד 10 שעות לאחר שחרור cilostamide, המציין הפעלה של תרגום interleukin 7 במהלך התבגרות מיוטית ביצית. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, ודא שזמן החשיפה מתאים בתחילת ההקלטה.
זכור כי האות עשוי לרוויה במהלך קורס הזמן אם התרגום מופעל במהלך חידוש meiotic ביצית. היציבות של MRMA עשויה להיות מאושרת על ידי PCR, באמצעות פריימרים עבור YFP. כדי לאשר שינויים בתרגום, אתה יכול להשתמש סופג מערבי עם נוגדן נגד טק V5.
