This research was supported in part by the University of Georgia, and a grant (HD071330) from the National Institutes of Health to MMV.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות ביצית, רכישה או טרי להכין בינוני מינימאלי חיוני (ממ) ולהשלים עם 3 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) כפי שמתוארים בטבלה 1. הנח בקבוק קלקר על איזון טעינה (טרה לאפס). הוסף את כל חומרים כימיים, למעט ה- BSA, על מנת ולהביא את הנפח הסופי עם MQ-מים לפי משקל לסך של 250 גרם. לאחר מכן להוסיף את BSA, מאפשר לפזר ולעקר מסנן. הערה: הבינוני ממ תאר דורש איזון ודגירת תא בתערובת גז רפואית של 5% CO 2, 5% O 2 ו- 90% N 2. עם זאת, כלי תקשורת אחרים (למשל, CZB) יכול לשמש המאפשרות לתא דגירה ב 5% CO 2 בתנאים אטמוספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור microinjection ביצית, לרכוש או להכין מדיום M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמ &#39;גונדוטרופין של סוסת מושלות בסרום (PMSG) לריכוז של 5 IU / 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה ולשקם מניות siRNA לריכוז עבודה של 1 מיקרומטר. </li></ol> 2. ביצית אוסף עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: כדי לעורר התפתחות זקיק בשחלה ולהגדיל את מספר הזקיקים טרום ביוץ, לנהל 5 IU של PMSG intraperitoneally לנקבות עכברים 48 שעות לפני איסוף ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: לאוסף ביצית ותרבות, להגדיר תרבות מנות 35 מ&quot;מ עם 3 מיליליטר של ממ / BSA בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר milrinone. מעכב phosphodiesterase זה שומר על הביציות בprophase-לעצור ומונע התמוטטות נבטי שלפוחית ​​(GVBD). לאזן את הכלים התרבות בתערובת גז רפואי לפחות 15 דקות. הערה: התקשורת בתוספת של milrinone נדרשת בכל אוסף ביצית, כמו גם microinjection ביצית ולאחר תקופת ההמתנה תרבות 24 שעות siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר השחלות מנקבות העכברים באמצעות מעבדה הוקמה מתרגל 15 ולהעביר לצלחת תרבות חדשה עם מראש התחממתי equilibrated ממ / BSA / milrinone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות על הבמה של סטראו לאוסף ביצית. שחרור קומולוס-ביצית מתחמים (COC של) על ידי ניקוב ידני זקיקי Antral עם 27 מחטי G. תקן שחלה אחת לתחתית צלחת התרבות, עם מחט 27 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר, ולהשתמש במחט שנייה לנקב את כל הזקיקים הגדולים. חזור על פעולה עבור כל השחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלי הפה pipetting סטנדרטיים או באמצעים אחרים של שאיפת ביצית, לאסוף את כל הביציות שמוקפות 2 שכבות או יותר של תאי קומולוס קומפקטיים. העבר את COC של למנה חדשה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את תאי קומולוס מקיפים על ידי pipetting העדין חזר עם טפטפת מיליליטר 1 מוגדר שאיפת נפח של 750 μl. חזור על שלב pipetting כ -12 פעמיםולאפשר לביציות להתאושש במשך 5 דקות. המשך בדרך זו עד שרוב תאי קומולוס הוסרו או כל. מעבירים את הביציות הערומות למנת תרבות אחרת ולאפשר לאזן על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקצות את הביציות הערומות לשלוש קבוצות ניסוי שישמש ל: microinjection (i) של siRNAs הספציפי נגד היעד של עניין, (ii) microinjection של siRNAs נוקבים (שליטה), וכן (iii) קבוצת ביקורת-מוזרק אינה כדי להסביר תנאי תרבות. </li></ol> 3. הביצית Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תרבות מנות עם 3 מיליליטר תקשורת M2 בתוספת milrinone (1 מיקרוגרם / מיליליטר) לmicroinjection ביצית. להכין מנות תרבות המכילות ממ / BSA / milrinone לשטיפה והתרבות הבאה של ביציות מוזרקות. הערה: בינוני M2 מכיל HEPES חיץ ודורש התחממות מראש על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנאים אטמוספריים. ממ דורש התחממות מראש ואיזון באמצעות גז רפואי כלתארד לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת microinjection. טען את מחט הזריקה עם 5 μl של פתרון siRNA ספציפי 1 מיקרומטר. Secure פיפטה האחזקה ומחט זריקה לmicromanipulators של מערכת microinjection והקים את יחידת ההזרקה עם נפח ולחץ מכוילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרו טיפת 200 μl של תקשורת M2 בצד הפנימי של המכסה של צלחת תרבות 3 סנטימטר ולהוסיף ביצית להתקנה וליישור של מערכת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בביצית כמדריך, להתאים את העמדות של מחטי האחזקה והזרקה. החל לחץ שלילי לפיפטה ההחזקה לאבטח בעדינות את הביצית ולהתאים את המיקום של מחט הזריקה לקוטר הרחב ביותר של התא. התאם את הגדרות כדי לאפשר microinjection של כ 10 pl של פתרון siRNA בכל מקום לתוך הציטופלסמה הביצית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> microinjection 1. ביצית איור להגדיר. ( <strong&gt; תמונה) נציג של מיקרו-טיפת 200 μl של תקשורת M2 ממוקמת על המכסה מצלחת תרבות 3 סנטימטר, עם מחט פיפטה האחזקה והזרקה ממוקמת על ימין ועל השמאל, בהתאמה. (ב) קבוצה של prophase-עצרתי ביציות (GV-שלבים) לפני microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את המכסה לשלב סטראו ולהוסיף מיקרו-טיפת 200 μl של תקשורת M2 הטרי. להוסיף קבוצה של ביציות (~ 10) למייקרו-הטיפה על ידי הפה pipetting, או שיטות חלופיות, ואז לחזור למכסה עם מיקרו-טיפה לבמה microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך microinject הביציות בודדות. Secure ביצית אחת עם פיפטה מחזיקה, הכנס באיטיות את קצה מחט ההזרקה לתוך הציטופלסמה ולגרש את עוצמת הזריקה של פתרון siRNA. לחזור מחט הזריקה ומו בזהירותיש ביצית שהוחדרו לעמדה בתחתית מיקרו הטיפה. הזז ביציות מוזרקות ללא הצלחה עמדה בראש מיקרו הטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך microinjection עם כל ביצית. כדי לשמור על כדאיות ביצית אופטימלית, microinject רק מספר קטן של ביציות בכל פעם. ודא שתהליך זה לא לוקח יותר מכמה דקות כדי למנוע טמפרטורה ו- pH שינויים במייקרו-הטיפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ביציות מוזרקות בהצלחה או להעביר בזהירות את המכסה עם מיקרו-הטיפה של ביציות הזריקו לסטראו. מעבירים את ביציות קיימא מוזרקים על ידי הפה pipetting או שיטות חלופיות, לממ / BSA בינוני / milrinone לשטוף ולאזן על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקבוצה אחרת של ביציות, לחזור על תהליך microinjection עם מחט זריקה חדשה עמוסה siRNAs שאינו ספציפי לקבוצת הביקורת. שטוף את הביציות בממ / BSA / milrinone והעברה לצלחת תרבות נפרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות כל הקבוצות שלביציות במשך 24 שעות בממ / BSA / milrinone על 37 מעלות צלזיוס באווירה של גז רפואי. הערה: תקופת התרבות &#39;בלוק milrinone&#39; נחוצה לדלדול mRNA / חלבון מטרה יעילה. </li></ol> 4. ביצית תרבות להבשלת meiotic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: לכל קבוצת ניסוי של ביציות הגדרת 4 מנות תרבות (35 מ&quot;מ) עם 3 מיליליטר ממ / BSA. להשלים מנה אחת לכל קבוצת תקשורת עם 10% בסרום שור עוברי (באיכות גבוהה) (FBS) לשימוש עבור הבשלת ביצית. אפשר את כל מנות התרבות לאזן על 37 מעלות צלזיוס עם תערובת גז רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר ביציות מ&#39;בלוק milrinone &#39;, ברצף לשטוף את הביציות שלוש פעמים במנות המכילות ממ / BSA ולאחר מכן להעביר את הביציות לצלחת ההתבגרות מכילה תקשורת עם 10% FBS. תרבות כל קבוצות הביצית במשך 17 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חידוש והתקדמות של מיוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות היכונו fixa ביצית: יום 5tion, כולל: paraformaldehyde 4% (PFA) במאגר PEM (i) (100 צינורות מ&quot;מ [pH 6.9], 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ EGTA) עם 0.5% Triton-X 100, וכן (ii) PBS בתוספת 5 FBS% שישמש כדי לשטוף ולחסום את הביציות. הערה: פתרונות אלה דורשים מראש התחממות עד 37 מעלות צלזיוס לפני קיבוע ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבעון ביצית (אחרי תרבות 17 שעות), במהירות להעביר את כל קבוצת ניסוי של ביציות על ידי הפה pipetting או שיטות חלופיות לבארות בודדות (של צלחת 4 היטב) המכיל 750 μl של טרום חימם 4% פתרון PFA ולדגור על 37 ° צלזיוס במשך שעה 1. בהמשך לכך לשטוף כל קבוצה של ביציות 3 פעמים (15 דקות כל אחד) ב -750 μl של PBS מראש חימם המכיל 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות בלוק בPBS / 5% FBS O / N 200 μl ב 4 ° C כדי למזער נוגדנים נוקבים מחייבות. </li></ol> ניתוח 5. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6: הערה: Immunostaining נעשה בצלחת רב גם וOOCytes מועברים באופן סדרתי לבארות רציפות, המכיל פתרונות נוגדן ולשטוף בהתאמה. או יכולים לשמש 48 או 96-גם צלחות, פשוט להתאים את הפתרון המבוסס על נפח גודל היטב. ל96-גם צלחות להשתמש 200 μl בכל טוב. ביציות מועברות לפתרונות השונים לפי הסדר הבא: פתרון נוגדן ראשוני - 3 בארות לשטוף - פתרון נוגדנים משני - 3 בארות לשטוף. כדי להגביל את החשיפה לאור הצלחת יכולה להיות מכוסות בנייר כסף. הכן FBS / 5% הטריים PBS ולהשתמש בפתרון זה כדי להכין דילולים נוגדן (למשל, אנטי-pericentrin ארנב (1/1000), אנטי-טובולין עכבר (1/1000)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביציות קבועות של כל קבוצת ניסוי לבארות בודדות המכילות 200 μl (או 100 μl, אם פחות נפח רצוי) של פתרון הנוגדן הראשוני ולכסות היטב עם parafilm. דגירה על פי תנאי נוגדן ספציפי אופטימליים (למשל, C ° 37 עבור שעה 1, או 4 ° CO / N). הערה: dilutio נוגדן ראשוניn כמו גם זמן דגירה ספציפי וטמפרטורה דורשים בדיקות כדי לקבוע את התנאים אופטימליים לנוגדנים שונים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם הנוגדן הראשוני, לשטוף את הביציות שלוש פעמים PBS / 5% FBS (10-15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביציות לתמיסה המכילה נוגדנים משני fluorescently- מצומדות (למשל, 1 / 1,000 דילול של נוגדנים נגד ארנב ואנטי עכבר מצומדות עם fluorochromes של אורכי גל שונים). דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביציות שלוש פעמים PBS / 5% FBS (10 - 15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לשטוף הסופי, להעביר את הביציות על גבי זכוכית נקייה ולשאוב בעדינות כל פתרון לשטוף עודף. זה יהיה לשתק את הביציות על משטח הזכוכית. הוסף 8 μl של ההרכבה תקשורת (המכיל DAPI) וכיסוי בזהירות תקשורת ההרכבה עם כיסוי להחליק x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ. מנמיכים את coverslip לאט, כדי למנוע השמנה בועות אוויר ו / או נזק לביציות. הערה: לחלופין, כדי לשמור על תכונות 3-מימדית של הביצית לניתוח מיקרוסקופיה confocal, להוסיף נפח קטן של 100 חרוזי זכוכית מיקרומטר (מעורבים עם וזלין) לפינות להחליק את המכסה לפני ההרכבה בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות חנות ב 4 מעלות צלזיוס, או להמשיך להערכת התקדמות meiotic כמו גם הניתוח של רמות ביטוי ולוקליזציה חלבון subcellular באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים יש צורך להתאים את הנוגדנים משני בשימוש. </li></ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes.">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li><li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance.">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li><li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry.">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li><li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes.">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li><li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization.">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li><li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes.">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li><li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome:+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling.">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li><li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1/Eg2+in+maturing+mouse+oocytes.">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li><li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+(GV)+of+mammalian+oocytes.">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li><li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development.">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li><li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference.">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li><li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi.">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

אמנם יש מספר שיטות להעברת חומצות גרעין אקסוגניים לתאים סומטיים, כגון electroporation וtransfection, microinjection הוא השיטה האופטימלית עבור משלוח של מולקולות RNA לביציות עכבר תעתיק שקטות. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה לדלדול במבחנה של mRNAs הספציפי המאפשר בדיקה הפונקציונלית של צי...

מיוזה היא תהליך החלוקה ייחודי המתרחש בתאי מין (ביציות וזרע) וכולל שתי חטיבות רצופות ללא התערבות סינתזת DNA להפריד כרומוזומים הומולוגיים וchromatids האחות במהלך מיוזה-אני ומיוזה-השנייה, בהתאמה 1. שגיאות בהפרדת כרומוזום במהלך חלוקת meiotic בביציות יכולות לגרום aneuploidy, שעובר בירושה על ידי העובר במהלך הפריה. יש לציין, השכיחות של aneuploidy בעוברים מתפתחים עולה עם עלייה בגיל האם והיא אחד גורמים עיקריים למומים מולדים, כמו גם אובדן הריון בנשים 1,2, וכך, מדגיש את הצורך חשוב להבין את הבסיס המולקולרי של aneuploidy במהלך חלוקת meiotic . במהלך חלוקת תא, הפרדה כרומוזום היא מכריע תלויה בהרכבה של מנגנון ציר microtubule והקמה של אינטראקציות כרומוזום-microtubule יציבה עבור התקשרות נכונה לציר הפוךקטבים. חשוב לציין, היווצרות ציר meiotic בביציות של יונקים שונים ממיטוזה בתאים סומטיים, ומוסדרת על ידי מרכזי ארגון-microtubule הייחודיים (MTOCs) שחסרי centrioles 3,4. חלבונים חיוניים נחוצים להתגרענות microtubule וארגון למקם לMTOCs ביצית, כולל γ טובולין שמזרז הרכבה microtubule. בנוסף, pericentrin פונקציות כמו חלבון פיגומים חיוני, אשר נקשר ועוגני γ טובולין, כמו גם גורמים אחרים בMTOCs 5. יש לציין, המחקרים שלנו מראים כי דלדול של חלבונים הקשורים-MTOC מפתח משבש ארגון ציר meiotic ומוביל לשגיאות הפרדת כרומוזום בביציות, שאינם מלא נפתרו על ידי מחסום ההרכבה ציר (SAC) 6,7. לכן, פגמים ביציבות ציר, שאינו מפעילים את מעצר meiotic, מהווים סיכון משמעותי בתרומה לaneuploidy. למרות התפקיד החיוני שלהם בהרכבת ציר וארגון, prot MTOC הביציתהרכב עין ותפקוד נשאר הבינו היטב. בדיקת תפקודם של חלבוני יעד ספציפיים בביציות יונקים היא מאתגרת, כמו התאים להפוך לתעתיק שקטים זמן קצר לפני חידוש מיוזה 8,9. לפיכך, ביציות מראש ביוץ להסתמך על חנויות mRNA אימהיות לחדש מיוזה ותומכות בחלוקה meiotic כמו גם חטיבות המחשוף הראשונות לאחר ההפריה 10,11. היעילות של התערבות RNA השפלה (RNAi) בתיווך של תעתיקי mRNA בביציות יונקים היא מבוססת היטב וRNAs האימהי גויס לתרגום במהלך התבגרות meiotic במיוחד נוח לsiRNA מיקוד 12-14. לכן, microinjection של RNAs התערבות הקצר (siRNAs) לביציות מספק גישה רבת ערך לרוקן mRNAs היעד לבדיקה פונקציונלית. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד של ביציות עכבר ודלדול בתיווך siRNA של transcri הספציפינק &#39;כדי לבדוק את התפקוד של חלבון הקשורים MTOC חיוני, pericentrin. בנוסף, אנו מתארים תנאי ניתוח immunofluorescence להעריך היווצרות ציר meiotic בביציות.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant Mare&#39;s Serum Gonadotropin (PMSG)</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>367222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>*Recipe outlined in Table 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#39;s Balanced Salt Solution (10x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, sodium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G, potassium salt&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin Sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, disodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential Amino Acids (50x)</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Mixture (100x)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milrinone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmbryoMax M2 Media with Hepes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>MR-015-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNAs targeting Pericentrin</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>GS18541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control siRNAs&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>SI03650318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16% solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pericentrin (rabbit)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin (mouse)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbbit Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti -mouse Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (SMZ 800)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtojet Micro-injections System</td>
			<td>Eppenforf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulators</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection needles (femtotips)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipettes (VacuTip)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm culture dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 mm CA Filter System</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>430768</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

meiotic spindle assessment in mouse oocytes by sirna-mediated silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Microinjection של siRNAs מספק גישה יעילה לשפלת mRNA ודלדול חלבון שלאחר מכן בביציות, המאפשר בדיקה פונקציונלית יעילה ומאוד ספציפית של גורמי יעד שונים במבחנה. בהמשך לכך, immunofluorescence משמש לניתוח פנוטיפ ספציפי, כמו גם כדי לאמת את דלדול חלבון בביציות מוזרק siRNA. בדוגמא הנוכחית, תיוג ?...

Watch this Scientific Journal Video about Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing at JoVE.com

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  College of Veterinary Medicine, University of Georgia.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות. 

Video: Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

העברת גרעין לתוך ביציות עכבר

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Previous studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells (ECs) survival, induced apoptotic cell death, a major obstacle in developing a cell culture system with prolonged ITSN-1s inhibition1. Using cationic liposomes as carriers, we explored the silencing of ITSN-1s gene in mouse lungs by systemic administration of siRNA targeting ITSN-1 gene (siRNAITSN). Cationic liposomes offer several advantages for siRNA delivery: safe with repeated dosing, nonimmunogenic, nontoxic, and easy to produce2. Liposomes performance and biological activity depend on their size, charge, lipid composition, stability, dose and route of administration3Here, efficient and specific KDITSN in mouse lungs has been obtained using a cholesterol and dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combination. Intravenous delivery of siRNAITSN/cationic liposome complexes transiently knocked down ITSN-1s protein and mRNA in mouse lungs at day 3, which recovered after additional 3 days. Taking advantage of the cationic liposomes as a repeatable safe carrier, the study extended for 24 days. Thus, retro-orbital treatment with freshly generated complexes was administered every 3rd day, inducing sustained KDITSN throughout the study4. Mouse tissues collected at several time points post-siRNAITSN were subjected to electron microscopy (EM) analyses to evaluate the effects of chronic KDITSN, in lung endothelium. High-resolution EM imaging allowed us to evaluate the morphological changes caused by KDITSN in the lung vascular bed (i.e. disruption of the endothelial barrier, decreased number of caveolae and upregulation of alternative transport pathways), characteristics non-detectable by light microscopy. Overall these findings established an important role of ITSN-1s in the ECs function and lung homeostasis, while illustrating the effectiveness of siRNA-liposomes delivery in vivo.

Repeated retro-orbital injections of cationic liposomes/siRNA/ITSN-1s complexes in mice, every 72 hours for 24 days, efficiently deliver the siRNA duplex to the mouse lung microvasculature reducing ITSN-1s mRNA and protein expression by 75%. This technique is highly reproducible in an animal model, has no adverse effects and avoids fatalities.

השתקה ארוכת טווח של Intersectin-1S בעכבר על ידי משלוח ריאות חוזר ונשנה של siRNA ספציפי באמצעות ליפוזומים קטיוני. הערכה של השפעות מציאה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video