שיטה זו מאפשרת הדמיה של מוח דג זברה בשלבים מאוחרים יותר של זחל כדי לאפשר את התצפית של הארכיטקטורה העצבית בצורה מפורטת מאוד ב vivo כי בעבר לא היה אפשרי. תאי פיגמנט, אשר הופיעו במהלך התפתחות זחל מאוחר יותר ומונע את המוח הדמיה ברורה, אינם בעיה עם שיטה זו כי הם פשוט מוסרים. בשיטה, יש ללמוד תהליכים המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר במהלך התפתחות הזחל של המוח, תהליכים המשפיעים על פלסטיות סינפטית, ניוון של נוירונים או התחדשותם.
לפני תחילת הניסוי השתמש במשיכת מיקרופיפט כדי להכין מחטי זכוכית חדות, דקות, מנימי זכוכית. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר פלסטיק כדי לאסוף זחל לתוך צלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ המכיל את הפתרון המתאים. מעבירים את הזחל הנבחר לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המכילה ACSF ומניחים 24 על 24 מילימטר, מרובע, כיסוי זכוכית להחליק לתוך מכסה צלחת פטרי.
ואז aliquot את הנפח של ACSF הדרוש לניסוי לתוך phial מתאים עבור חמצון עם קרבוגן. כדי להטמיע את הזחל, השתמש בצינור פסטר כדי להעביר את הזחל המרדים לתא הרכבה מתחת לסטריאומיקרוסקופ. אם כל זחל עדיין מסוגלים לזוז, לא להשתמש בדגים לניסוי עד הדגים אינם מסוגלים לזוז לחלוטין.
כאשר הזחלים הם חסרי תנועה, בזהירות להסיר את מדיום עודף מיד להוסיף לפחות מיליליטר אחד של אגרוז נמס נמוך על הזחל. כוון את דג הזברה עם אזור הגב הפונה למעלה קרוב ככל האפשר לפני השטח של האגארוז. אם הזחל יצולם באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לאחר התחזקות, גזמו את האגורוז המכיל את הזחל לבלוק קובואידי קטן.
כדי לחשוף את המוח להדמיה, לקצץ את עודף agarose מעל אזור המוח של עניין לפי הצורך ולהשתמש במחט זכוכית כדי להפוך חתך קטן דרך העור ליד, אבל לא מעל, אזור העניין מבלי לחדור עמוק מדי לתוך הרקמה. בקושי להזיז את המחט ממש מתחת לפני העור, להמשיך בזהירות לעשות חתכים קטנים מאוד סביב אזור העניין עד העור מעל אזור העניין ניתן להסיר או לדחוף הצידה. כאשר הרקמה הוסרה מכל העוברים, הוסף טיפה קטנה של אגרוז נמס נמוך לתא ההדמיה שהוכן בעבר של מיקרוסקופ הפוך והשתמש במרית קטנה כדי להפוך את בלוק אגרוז הקוביואיד 180 מעלות על טיפת האגרוז בתא ההדמיה.
כאשר האגורוז התגבש, מלאו את תא ההדמיה ב-ACSF טרי והתחילו להדמיה את הזחל. כאן, זחל מהונדס שלם 14 ימים לאחר ההפריה עם הגולגולת עדיין שלם ניתן לראות. כפי שמוצג, תאי הפיגמנט בתוך העור המניח מפוזרים על כל הראש, מפריעים לאות הפלואורסצנטי באזור העניין.
לאחר ניתוח גולגולת פתוח, תחום העניין הופך לנגיש באופן חופשי להדמיה מפורטת ברזולוציה גבוהה. מחסום העור, הגולגולת או מוח הדם מעכבים גם את חדירת החומרים למוח, כפי שממחיש צבע גרעיני איתן הכתם שנצפו בתאי מוח אלה רק לאחר ניתוח גולגולת פתוח. יתרונות אלה נצפים גם ב 30 ימים לאחר ההפריה.
בדגים מהונדסים המכילים כלי דם מוחי פלואורסצנטי בשל הביטוי של חלבון פלואורסצנטי אדום, mCherry, בתאי אנדותל, קידוד צבע בערכי העומק של מחסנית התמונה מדגים כי אפילו כלי דם קבורים עמוק בתוך המוח כמעט 250 מיקרון עדיין גלויים בבירור למעקב. בעת ביצוע הליך זה תמיד יש לזכור כי זהו ניתוח בחיה חיה. לכן, זה דורש כבוד ונפש ממוקדת.
לאחר הליך זה, הקלטה של המורפולוגיה העצבית, כולל מבנים סינפטיים, אירועי הובלה פיזיולוגיים תאיים יכולה להתבצע בזחלים מעל שבעה ימים לאחר ההפריה. בטכניקה זו, אנו מקווים לספק גישה המאפשרת לחקור גם תהליכים תאיים במוח המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר של זחל, וכי הם מעורבים ביצירת, למשל, התנהגויות מורכבות כגון התנהגות חברתית או קבלת החלטות.
