이 방법은 나중에 애벌레 단계에서 Zebrafish 뇌의 시각화를 허용하여 이전에는 불가능했던 생체 내에서 매우 상세한 방식으로 신경 아키텍처를 관찰할 수 있습니다. 나중에 애벌레 발달 도중 나타나고 명확한 화상 진찰에서 두뇌를 방지하는 안료 세포는, 단순히 제거되기 때문에 이 방법에 아무 문제가 없습니다. 이 방법으로, 뇌의 애벌레 발달 중에 나중에 발생하는 프로세스, 시냅스 가소성, 뉴런의 변성 또는 재생에 영향을 미치는 과정을 연구할 수 있어야 합니다.
실험을 시작하기 전에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관에서 날카로운, 얇은 유리 바늘을 준비합니다. 다음으로 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 적절한 용액을 포함하는 90mm 직경의 페트리 접시에 애벌레를 수집합니다. 선택한 유충을 ACSF가 들어있는 35밀리미터 직경의 페트리 접시에 옮기고 24 by 24밀리미터, 사각형, 유리 커버를 페트리 접시 뚜껑에 놓습니다.
그런 다음 실험에 필요한 ACSF의 부피를 카보겐으로 산소화에 적합한 phial로 알리쿼트합니다. 유충을 포함하려면 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 유충을 스테레오 현미경으로 마운팅 챔버로 옮겨 넣습니다. 어떤 애벌레가 여전히 움직일 수 있다면, 물고기가 완전히 움직일 수 없을 때까지 실험을 위해 물고기를 사용하지 마십시오.
유충이 움직이지 않는 경우, 조심스럽게 초과 매체를 제거하고 즉시 애벌레에 낮은 녹는 아가로즈의 적어도 1 밀리리터를 추가합니다. 가로즈 표면에 최대한 가깝게 향하는 등지와 얼룩말 피시를 오리엔테이션합니다. 애벌레가 거꾸로 된 현미경을 사용하여 이미지화될 경우, 굳건한 후 애벌레를 포함하는 아가로즈를 작은 큐비드 블록으로 다듬는다.
이미징을 위해 뇌를 노출하려면 필요에 따라 뇌 영역에 과도한 아가로즈를 잘라내고 유리 바늘을 사용하여 근처의 피부를 통해 작은 절개를 하지만 끝나지 않고 조직에 너무 깊이 침투하지 않고 관심 영역을 사용하십시오. 간신히 피부 표면 바로 아래에 바늘을 이동, 주의 깊게 관심 의 영역을 통해 피부를 제거하거나 옆으로 밀어 수 있을 때까지 관심의 영역 주위에 아주 작은 상처를 계속. 조직이 모든 배아에서 제거되었을 때, 거꾸로 된 현미경의 이전에 준비 된 이미징 챔버에 낮은 녹는 아가로즈의 작은 방울을 추가하고 작은 주걱을 사용하여 이미징 챔버의 아가로즈 드롭에 180도 의 가가로즈 블록을 뒤집습니다.
아가로즈가 고화되면 이미징 챔버를 신선한 ACSF로 채우고 애벌레를 이미징하기 시작합니다. 여기서, 두개골이 그대로 있는 14일 후 비옥한 형질전환유충을 그대로 관찰할 수 있다. 도시된 바와 같이, 과부하 피부 내의 안료 세포는 머리 전체에 분포되어 관심 영역에서 형광 신호를 방해합니다.
두개골 수술을 받은 후, 관심 분야는 상세한 고해상도 이미징을 위해 자유롭게 접근할 수 있게 됩니다. 피부, 두개골 및 혈액 뇌 장벽은 또한 두개골 수술 후에만 이 뇌 세포에서 관찰된 강력한 핵 염료 염색에 의해 설명된 바와 같이 뇌내 물질의 침투를 방해합니다. 이러한 장점은 또한 30 일 후에 수정 후에 관찰됩니다.
적색 형광 단백질의 발현으로 인한 형광뇌 혈관을 함유하는 형질형 물고기에서, mCherry는 내피 세포에서, 이미지 스택의 깊이 값에서 색 코딩조차도 거의 250 미크론에 뇌 내에 깊이 묻혀 있는 혈관조차도 여전히 명확하게 보이고 추적할 수 있음을 보여줍니다. 이 절차를 수행 할 때 항상이 살아있는 동물의 수술임을 명심하십시오. 따라서 존중과 집중된 마음이 필요합니다.
이 절차 후, 시냅스 구조, 생리학적 및 세포 내 수송 이벤트를 포함한 뉴런 형태의 기록은 7일 이상의 유충에서 수행될 수 있다. 이 기술을 사용하여, 우리는 나중에 애벌레 단계에서 생기는 두뇌에 있는 세포 프로세스를 또한 연구할 수 있는 접근을 제공하기를 희망합니다, 예를 들면, 사회적인 행동 또는 의사 결정과 같은 복잡한 행동을 설치에 관련시키는 관련시키는.
