Diese Methode ermöglicht die Visualisierung des Zebrafischgehirns in späteren Larvenstadien, um die beobachtung der neuronalen Architektur in vivo sehr detailliert zu ermöglichen, die bisher nicht möglich war. Pigmentzellen, die bei späterer Larvenentwicklung entstanden sind und das Gehirn an einer klaren Bildgebung hindern, sind bei dieser Methode kein Problem, da sie einfach entfernt werden. Mit der Methode sollen Prozesse untersucht werden können, die in späteren Stadien während der Larvenentwicklung des Gehirns auftreten, Prozesse, die sich auf die synaptische Plastizität, die Degeneration von Neuronen oder deren Regeneration auswirken.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, verwenden Sie einen Mikropipettenzieher, um scharfe, dünne Glasnadeln aus Glaskapillaren vorzubereiten. Als nächstes verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Kunststoff, um Larven in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 90 Millimetern zu sammeln, die die entsprechende Lösung enthält. Übertragen Sie die ausgewählte Larve auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern, die ACSF enthält, und legen Sie einen 24 x 24 Millimeter großen, quadratischen Glasdeckel in den Deckel der Petrischale.
Aliquotieren Sie dann das für das Experiment benötigte ACSF-Volumen in eine geeignete Ampale für die Sauerstoffversorgung mit Carbogen. Um die Larve einzubetten, verwenden Sie eine Pasteur-Pipette, um die betäubte Larve in eine Montagekammer unter einem Stereomikroskop zu übertragen. Wenn sich noch Larven bewegen können, verwenden Sie die Fische nicht für das Experiment, bis die Fische sich vollständig bewegen können.
Wenn die Larve unbeweglich ist, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Medium und fügen Sie sofort mindestens einen Milliliter niedrigschmelzender Agarose auf die Larve hinzu. Orientieren Sie den Zebrafisch mit der Rückenregion so nah wie möglich an der Oberfläche der Agarose. Wenn die Larve mit einem invertierten Mikroskop abgebildet wird, schneiden Sie nach einer Erstarrung die Agarose, die die Larve enthält, in einen kleinen Quaderblock.
Um das Gehirn für die Bildgebung freizulegen, schneiden Sie die überschüssige Agarose über der interessierenden Hirnregion nach Bedarf weg und verwenden Sie eine Glasnadel, um einen kleinen Schnitt durch die Haut in der Nähe, aber nicht über der interessierenden Region zu machen, ohne zu tief in das Gewebe einzudringen. Bewegen Sie die Nadel kaum direkt unter der Hautoberfläche, machen Sie weiterhin vorsichtig sehr kleine Schnitte um den interessierenden Bereich, bis die Haut über dem interessierenden Bereich entfernt oder zur Seite geschoben werden kann. Wenn das Gewebe von allen Embryonen entfernt wurde, fügen Sie einen kleinen Tropfen niedrigschmelzender Agarose in die zuvor vorbereitete Bildgebungskammer eines invertierten Mikroskops hinzu und verwenden Sie einen kleinen Spatel, um den quaderförmigen Agaroseblock um 180 Grad auf den Agarosetropfen in der Bildgebungskammer zu drehen.
Wenn die Agarose erstarrt ist, füllen Sie die Bildgebungskammer mit frischem ACSF und beginnen Sie mit der Bildgebung der Larve. Hier kann eine intakte 14 Tage nach der Befruchtung transgene Larve mit noch intaktem Schädel beobachtet werden. Wie gezeigt, sind die Pigmentzellen in der überlagernden Haut über den ganzen Kopf verteilt und stören das fluoreszierende Signal im interessierenden Bereich.
Nach einer offenen Schädeloperation wird das Interessengebiet für eine detaillierte hochauflösende Bildgebung frei zugänglich. Die Haut-, Schädel- und/oder Blut-Hirn-Schranke behindern auch das Eindringen von Substanzen in das Gehirn, wie die robuste Kernfarbstofffärbung zeigt, die in diesen Gehirnzellen erst nach einer offenen Schädeloperation beobachtet wird. Diese Vorteile werden auch 30 Tage nach der Befruchtung beobachtet.
Bei transgenen Fischen, die aufgrund der Expression des rot fluoreszierenden Proteins mCherry in Endothelzellen ein fluoreszierendes Hirngefäßgefäß enthalten, zeigt die Farbkodierung bei den Tiefenwerten des Bildstapels, dass selbst Tief im Gehirn bis fast 250 Mikrometer tief vergrabene Blutgefäße noch deutlich sichtbar und nachvollziehbar sind. Denken Sie bei der Durchführung dieses Verfahrens immer daran, dass es sich um eine Operation an einem lebenden Tier handelt. Daher erfordert es Respekt und einen fokussierten Geist.
Nach diesem Verfahren kann die Aufzeichnung der neuronalen Morphologie, einschließlich synaptischer Strukturen, physiologischer und intrazellulärer Transportereignisse bei Larven durchgeführt werden, die älter als sieben Tage nach der Befruchtung sind. Mit dieser Technik wollen wir einen Ansatz bieten, der es ermöglicht, auch zelluläre Prozesse im Gehirn zu untersuchen, die in späteren Larvenstadien auftreten und die beispielsweise an der Etablierung so komplexer Verhaltensweisen wie Sozialverhalten oder Entscheidungsfindung beteiligt sind.
