Cette méthode permet la visualisation du cerveau du poisson-zèbre dans les stades larvaires ultérieurs pour permettre l’observation de l’architecture neuronale d’une manière très détaillée in vivo qui n’a pas été possible auparavant. Les cellules pigmentaires, qui ont émergé au cours du développement larvaire ultérieur et empêchent le cerveau d’une imagerie claire, ne mettent aucun problème avec cette méthode car elles sont simplement enlevées. Avec la méthode, il devrait être possible d’étudier les processus qui se produisent à des stades ultérieurs au cours du développement larvaire du cerveau, les processus qui ont un impact sur la plasticité synaptique, la dégénérescence des neurones ou leur régénération.
Avant de commencer l’expérience, utilisez un tireur de micropipette pour préparer des aiguilles de verre pointues et minces à partir de capillaires en verre. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur en plastique pour recueillir les larves dans une boîte de Petri de 90 millimètres de diamètre contenant la solution appropriée. Transférer la larve sélectionnée dans une boîte de Petri de 35 millimètres de diamètre contenant du FSC et placer un couvercle en verre carré de 24 par 24 millimètres dans le couvercle de la boîte de Pétri.
Ensuite, aliquotez le volume d’ACSF nécessaire à l’expérience dans une fiole appropriée pour l’oxygénation avec du carbogène. Pour intégrer la larve, utilisez une pipette Pasteur pour transférer la larve anesthésiée dans une chambre de montage sous un stéréomicroscope. Si une larve est encore capable de se déplacer, n’utilisez pas le poisson pour l’expérience jusqu’à ce que les poissons soient complètement incapables de bouger.
Lorsque la larve est immobile, retirez soigneusement l’excès de milieu et ajoutez immédiatement au moins un millilitre d’agarose à faible fonte sur la larve. Orientez le poisson-zèbre avec la région dorsale tournée vers le haut aussi près que possible de la surface de l’agarose. Si la larve doit être imagée à l’aide d’un microscope inversé, après une solidification, coupez l’agarose contenant la larve en un petit bloc cuboïde.
Pour exposer le cerveau à l’imagerie, coupez l’excès d’agarose sur la région du cerveau d’intérêt si nécessaire et utilisez une aiguille en verre pour faire une petite incision à travers la peau près, mais pas au-dessus, de la région d’intérêt sans pénétrer trop profondément dans le tissu. En déplaçant à peine l’aiguille juste sous la surface de la peau, continuez à faire soigneusement de très petites coupes autour de la région d’intérêt jusqu’à ce que la peau sur la région d’intérêt puisse être enlevée ou écartée. Lorsque le tissu a été retiré de tous les embryons, ajoutez une petite goutte d’agarose à faible fusion à la chambre d’imagerie préalablement préparée d’un microscope inversé et utilisez une petite spatule pour retourner le bloc d’agarose cuboïde à 180 degrés sur la goutte d’agarose dans la chambre d’imagerie.
Lorsque l’agarose s’est solidifiée, remplissez la chambre d’imagerie avec du LCR frais et commencez à imager la larve. Ici, une larve transgénique intacte de 14 jours après la fécondation avec le crâne encore intact peut être observée. Comme indiqué, les cellules pigmentaires dans la peau superposée sont réparties sur toute la tête, interférant avec le signal fluorescent dans la région d’intérêt.
Après une chirurgie du crâne ouvert, la zone d’intérêt devient librement accessible pour une imagerie détaillée à haute résolution. La barrière de la peau, du crâne et/ou du sang-encéphalique entrave également la pénétration de substances dans le cerveau, comme l’illustre la coloration robuste des colorants nucléaires observée dans ces cellules cérébrales seulement après une chirurgie du crâne ouvert. Ces avantages sont également observés 30 jours après la fécondation.
Chez les poissons transgéniques contenant une vascularisation cérébrale fluorescente due à l’expression de la protéine fluorescente rouge, mCherry, dans les cellules endothéliales, le codage couleur aux valeurs de profondeur de la pile d’images démontre que même les vaisseaux sanguins profondément enfouis dans le cerveau à près de 250 microns sont encore clairement visibles et traçables. Lorsque vous effectuez cette procédure, gardez toujours à l’esprit qu’il s’agit d’une chirurgie chez un animal vivant. Par conséquent, cela nécessite du respect et un esprit concentré.
Après cette procédure, l’enregistrement de la morphologie neuronale, y compris les structures synaptiques, les événements physiologiques et de transport intracellulaire peut être effectué chez les larves âgées de plus de sept jours après la fécondation. Avec cette technique, nous espérons fournir une approche qui permet d’étudier également les processus cellulaires dans le cerveau qui se produisent à des stades larvaires ultérieurs, et qui sont impliqués dans l’établissement, par exemple, de comportements complexes tels que le comportement social ou la prise de décision.
