Bu yöntem, Zebra balığı beyninin daha sonraki larva aşamalarında görselleştirilmesine izin vererek nöronal mimarinin daha önce mümkün olmayan son derece ayrıntılı bir şekilde in vivo olarak gözlemlenmesine izin verir. Daha sonra larva gelişimi sırasında ortaya çıkan ve beynin net görüntülemesini engelleyen pigment hücreleri, basitçe çıkarıldığı için bu yöntemde sorun oluşturmaz. Yöntemle, beynin larva gelişimi sırasında daha sonraki aşamalarda meydana gelen süreçleri, sinaptik plastisiteyi etkileyen süreçleri, nöronların dejenerasyonunu veya yenilenmelerini incelemek mümkün olmalıdır.
Deneye başlamadan önce cam kılcal damarlardan keskin, ince, cam iğneler hazırlamak için bir mikropipette puller kullanın. Daha sonra, larvaları uygun çözeltiyi içeren 90 milimetre çapında bir Petri kabına toplamak için plastik bir Pasteur pipet kullanın. Seçilen larvayı ACSF içeren 35 milimetre çapında bir Petri kabına aktarın ve Petri kabı kapağına 24 ila 24 milimetrelik kare, cam bir kapak kayması yerleştirin.
Daha sonra deney için gereken ACSF hacmini karbojen ile oksijenlenme için uygun bir phial içine aliquot. Larvaları gömmek için, uyuşturulmuş larvayı stereomikroskop altında bir montaj odasına aktarmak için bir Pasteur pipet kullanın. Herhangi bir larva hala hareket edebiliyorsa, balıklar tamamen hareket edemeyene kadar deney için balıkları kullanmayın.
Larva hareketsiz olduğunda, fazla ortamı dikkatlice çıkarın ve hemen larvaya en az bir mililitre düşük erime agaroz ekleyin. Zebra balığını sırt bölgesi agaroz yüzeyine mümkün olduğunca yakın olacak şekilde yönlendirin. Larva ters bir mikroskop kullanılarak görüntülenecekse, katılaştıktan sonra larvayı içeren agazozları küçük bir küboid bloğuna kırpın.
Beyni görüntüleme için ortaya çıkarmak için, ilgi çekici beyin bölgesi üzerindeki fazla agaroseyu gerektiği gibi kesin ve dokuya çok derinlemesine nüfuz etmeden ilgi alanına yakın, ancak üzerinde olmayan ciltten küçük bir kesi yapmak için cam bir iğne kullanın. İğneyi cilt yüzeyinin hemen altında zar zor hareket ettirerek, ilgi alanı üzerindeki cilt çıkarılıncaya veya kenara itilene kadar ilgi alanı çevresinde çok küçük kesikler yapmaya devam edin. Doku tüm embriyolardan çıkarıldığında, ters bir mikroskobun daha önce hazırlanmış görüntüleme odasına küçük bir damla düşük erime agaz ekleyin ve küboid agarose bloğunu görüntüleme odasındaki agarose damlasına 180 derece çevirmek için küçük bir spatula kullanın.
Agarose katılaştığında, görüntüleme odasını taze ACSF ile doldurun ve larvaları görüntülemeye başlayın. Burada, kafatası hala sağlam olan 14 günlük döllenme sonrası transgenik larva gözlemlenebilir. Gösterildiği gibi, kaplama derisi içindeki pigment hücreleri başın her yerine dağıtılır ve ilgi çekici bölgedeki floresan sinyaline müdahale eder.
Açık kafatası ameliyatından sonra, ayrıntılı yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ilgi alanına serbestçe erişilebilir hale gelir. Deri, kafatası ve kan beyin bariyeri, bu beyin hücrelerinde sadece açık kafatası ameliyatından sonra gözlenen sağlam nükleer boya lekelemesinde gösterildiği gibi, maddelerin beyne nüfuz etmesine de engel olur. Bu avantajlar döllenme sonrası 30 günde de gözlenir.
Kırmızı floresan proteinin ekspresyonu nedeniyle floresan beyin damarı içeren transgenik balıklarda, mCherry, endotel hücrelerinde, görüntü yığınının derinlik değerlerinde renk kodlaması, beynin içinde yaklaşık 250 mikrona kadar derinden gömülü olan kan damarlarının bile hala açıkça görülebildiği ve izlenebilir olduğunu göstermektedir. Bu işlemi yaparken her zaman bunun yaşayan bir hayvanda bir ameliyat olduğunu unutmayın. Bu nedenle, saygı ve odaklanmış bir zihin gerektirir.
Bu işlemden sonra, gübreleme sonrası yedi günden daha eski larvalarda sinaptik yapılar, fizyolojik ve hücre içi taşıma olayları da dahil olmak üzere nöronal morfolojinin kaydı yapılabilir. Bu teknikle, beyinde daha sonraki larva aşamalarında meydana gelen ve örneğin sosyal davranış veya karar verme gibi karmaşık davranışların oluşturulmasında rol oynayan hücresel süreçleri de incelemeye izin veren bir yaklaşım sağlamayı umuyoruz.
