אנו מודים שון Pelkowski לסיוע באופטימיזציה של assay התנהגותית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, R01 HD060647 והמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, F32 ES021342 וR03 ES017755.

1. אוסף של עוברי דג הזברה וגיוס זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זכוכית פיירקס עם דשא &quot;מזויף&quot; (עשוי מחוט ירוק) (איור 1) צריכים להיות מוכנסות למכלי עם שחר ועזבו בלמשך שעתיים כדי לאסוף עוברי דג הזברה. מנות הזכוכית המכילות את העוברים צריכים להיות שפך על מסננת כף יד ולשטוף עם מים deionized. את העוברים ואז צריכים להיות מבוגרים במי ביצה. המים הביצה מכילים 60 מ&quot;ג / ליטר של אוקיינוס ​​מיידי במי deionized ו0.25 מ&quot;ג / ל &#39;של מתילן כחול, המשמש כמעכב עובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם להשערה של הניסוי הבודד, ניתן לטפל בעוברים באופן מיידי או במהלך שלבים מסוימים של פיתוח באמצעות toxicants או תרופות. את toxicants והתרופות בדרך כלל מומסים DMSO (בריכוז X 1,000) וצריכים להיות מדולל נוסף ישירות במדיום המים הביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך טיפול עוברי וזחל עם תרופות או toxicantים, יכולים להיות שוכנו הזחלים והעוברים בצלחות פטרי עמוקים בצפיפות של כ 50-60 זחלים לכל 50 מ&quot;ל עד ניתוחי ההתנהגות ב7 DPF (פתרון מים ביצה צריך להיות שונה לפחות בכל יום אחר, כדי למנוע התפתחות של פטרייה / חיידק מעוברים מתים). </li></ol> 2. הכנת תבניות לניתוח התנהגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיוחד התפתח תבניות פלסטיק שבם נמדד 11.7 ס&quot;מ X 7.6 ס&quot;מ X 5 מ&quot;מימ מותאמים אישית שנבנו בתוך הבית. את התבניות יש צורך ליצור נתיבים באמצעות agarose שהוא שפך לתוך צלחות פלסטיק גם בודדות מThermo Scientific. מדד הצלחות גם אחת 12.4 ס&quot;מ X 8.1 ס&quot;מ X 1.2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את התבניות מכילות חמישה נתיבים שבו הצדדים הם בזווית של 60 מעלות. הנתיבים בתבניות הם 3.5 מ&quot;מ גבוה עם בסיס של 18 מ&quot;מ בחלקו העליון שהוא הרחב ביותר ואילו הרוחב התחתון הוא 14 מ&quot;מ. יש פער בין 4 מ&quot;מ נתיבים בתבנית (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הנתיבים לשפוך 50 מ&quot;ל של agarose נמס (0.8% agarose בdeionizeמים D עם 60 מ&quot;ג / ליטר מיידי אוקיינוס) בצלחת גם יחידה. אז העובש צריך להיות ממוקם באיטיות על גבי agarose הנוזלית כדי לחסל כל היווצרות בועה וניתן להסיר כאשר agarose מתקררת (שלוקח בערך 45 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתיבי agarose צריכים להתבצע לא לפני יום אחד לפני הניסוי התנהגותי הוא להיות לרוץ (כדי למנוע התייבשות agarose) יכולים להיות מאוחסנים הנתיבים בטמפרטורת חדר עם את המכסים על הכלים עד בערך 36 שעות. נתיבי agarose יש להשתמש רק בניסוי אחד ולאחר מכן צריכים להיות מושלך. </li></ol> 3. לכידת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 20 זחלים יכולים להיות ממוקמים בכל מסלול של הצלחות. בדרך כלל 5 זחלים לכל נתיב המשמשים כדי להקל על המעקב מדויק ביותר של מהירות השחייה ולהפחית את מספר הזחלים שיש צורך לניסוי. יכולות להיות מלאות בסמטאות במי ביצה עם או בלי תרופות או toxicants בהתאם לניסוי. עם זאת, מסלולים לא צריכים להיות Filled את כל הדרך עד שהם ממוקמים בארונות ההדמיה; זה ימנע הצפה. לעקביות, הזחלים צריכים תקופת התאקלמות של עשר דקות אחרי שהם ממוקמים בתבניות agarose ואת מיקומו על גבי מסך המחשב הנייד. יעילות העברת הזחלים מצלחת פטרי לנתיב agarose תעזור להפחית את לחץ זחלים. זה קל כשהם שוכנו בזחלי טנקים רדודים או צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את ארונות ההדמיה כוללים מצלמה דיגיטלית Canon משמשת לצילום זמן לשגות ומחשב נייד. המצלמה צריכה להיות ממוקמת בחלקו העליון של הארון וכיוון לעבר לחלקו התחתון של הארון שבו מחשב נייד מסך 15.6 אינץ&#39; צריך להיות ממוקם עם המסך כלפי מעלה (איור 3). ארבע צלחות צריכים להיות ממוקמות ביד ישירות על גבי מסך המחשב הנייד. בשלב זה ניתן עקף את הנתיבים במי ביצה או טיפול כימי, כך שהוא ברמה עם החלק העליון של המסלול (כדי לחסל את הצללים בשולי Lanes בתמונות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצגת PowerPoint משמשת כגירוי מרתיע לזחלים. בכדורים האדומים הנעים בעבר הוצגו בדג הזברה זחלים 6 או 12 צלחות רב גם 15,17,18. PowerPoint הנוכחי מתחיל עם רקע לבן ריק במשך 15 דקות, ואחרי 15 דקות של בר אדום נע במחצית העליונה של הצלחת (איור 4). על מנת למנוע התחממות יתר של הזחלים, עדיף לרכוש מחשב נייד עם מסך טמפרטורה שאינו עולה מעל 28 מעלות צלזיוס כדי למנוע אידוי של הנוזל בתוך נתיבי agarose, זמן ההדמיה המקסימאלי צריך להיות כל הזמן מתחת לשעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצלמה הדיגיטלית צריכה להיות מתוכנת לצילום זמן לשגות, לצלם כל 6 שניות לסכום כולל של 300 תמונות לכל ניסוי. עם זאת, ניתן להתאים את התדירות ואת האורך בהתאם לניסוי והכימות התנהגותית. בכל הפעמים האחרונות הרחבנו ההדמיה הועסקו באמצעות מרווחי זמן בין כל תמונה. Camerניתן להגדיר ברזולוציה נמוכה יותר עבור הדמיה במהירות וידאו (30 פריימים לשנייה). אמנם הרזולוציה הנמוכה מגבילה את ההקלטות לצלחת multiwell אחת, את קלטות הווידאו מתאימות לאירועי שחייה מהירות הדמיה 15. </li></ol> 4. ניתוח תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את התמונות יש לפתוח עם ImageJ ולהשתמש בו עם מאקרו שנכתב במיוחד בבית. מאקרו באופן אוטומטי מחלק את ערוצי הצבע, כך שניתן להסיר את הצבע האדום, מחסיר את הרקע, חל סף, ומזהה את הזחלים על ידי ניתוח חלקיקים. מאקרו העדכני ביותר עבור חמישה ניתוח הזחל ליין הוא Zebrafish_macro25k. השתמש בהנחיות במאקרו כדי להגדיר מספר התמונות, צבע שיורד, סף תמונה, וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל התמונות מנוהלים באמצעות מאקרו ImageJ, קובץ יוצג תוצאות ויכיל x, y קואורדינטות של הזחלים פרטניים לכל תמונה, יחד עם מספר התמונה ומספר המסלולים. </p&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> קובץ התוצאות צריך להישמר בפורמט אקסל ומסודר על בסיס רקע ריק לעומת רקע שורה מרגשת ולאחר מכן את המספר היטב. תבנית Excel צריכה להיות בשימוש שיש משוואות שנבנו שבקובעו באופן אוטומטי את המיקום של זחלים בבארות, מרחק בין זחלים, מהירות תנועה, ואת סכום של מנוחה. התבנית הנוכחית של Excel ביותר נוצרה במעבדה 25ib Creton, אשר זמינה על פי דרישה. גרפים מראים קבוצות טיפול שונות צריכים להיות מובנים בתוך גיליון Excel יחד עם מבחני t להשוואה בין קבוצות טיפול ובקרה. ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי נוסף באמצעות SPSS. </li></ol>

<ol>
	<li>Gerlai, R., Lahav, M., Guo, S., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drinks+like+a+fish:+zebra+fish+(Danio+rerio)+as+a+behavior+genetic+model+to+study+alcohol+effects.">Drinks like a fish: zebra fish (Danio rerio) as a behavior genetic model to study alcohol effects.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 67, 773-782 (2000).</li><li>Selderslaghs, I. W. T., Hooyberghs, J., De Coen, W., Witters, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+in+zebrafish+embryos:+A+new+method+to+assess+developmental+neurotoxicity.">Locomotor activity in zebrafish embryos: A new method to assess developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 460-471 (2010).</li><li>Norton, W., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+organism+for+behavioural+genetics.">Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics.</a> BMC Neuroscience. 11, 90 (2010).</li><li>Levin, E. D., Cerutti, D., Buccafusco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+15.">Ch. 15.</a> Methods of behavioral analysis in neuroscience. , (2009).</li><li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. , 203-253 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kokel, D., Bryan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+behavior-based+identification+of+neuroactive+small+molecules+in+the+zebrafish.">Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 231-237 (2010).</li><li>Rihel, J., Prober, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Behavioral+Profiling+Links+Drugs+to+Biological+Targets+and+Rest/Wake+Regulation.">Zebrafish Behavioral Profiling Links Drugs to Biological Targets and Rest/Wake Regulation.</a> Science. 327, 348-351 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+behavioral+and+endocrine+responses+to+novelty+stress+in+adult+zebrafish.">Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5, 1786-1799 (2010).</li><li>Cachat, J., Stewart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Neurophenotyping+of+Adult+Zebrafish+Behavior.">Three-Dimensional Neurophenotyping of Adult Zebrafish Behavior.</a> PLoS ONE. 6, e17597 (2011).</li><li>Sledge, D., Yen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+duration+of+exposure+for+developmental+chlorpyrifos-induced+neurobehavioral+toxicity.">Critical duration of exposure for developmental chlorpyrifos-induced neurobehavioral toxicity.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33, 742-751 (2011).</li><li>Stewart, A., Wu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+anxiety-like+phenotypes+in+adult+zebrafish+behavioral+models.">Pharmacological modulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 1421-1431 (2011).</li><li>Eddins, D., Cerutti, D., Williams, P., Linney, E., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+provide+a+sensitive+model+of+persisting+neurobehavioral+effects+of+developmental+chlorpyrifos+exposure:+comparison+with+nicotine+and+pilocarpine+effects+and+relationship+to+dopamine+deficits.">Zebrafish provide a sensitive model of persisting neurobehavioral effects of developmental chlorpyrifos exposure: comparison with nicotine and pilocarpine effects and relationship to dopamine deficits.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32, 99-108 (2010).</li><li>Emran, F., Rihel, J., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+behavioral+assay+to+measure+responsiveness+of+zebrafish+to+changes+in+light+intensities.">A behavioral assay to measure responsiveness of zebrafish to changes in light intensities.</a> J. Vis. Exp. (20), e923 (2008).</li><li>Pelkowski, S., Kapoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+high-throughput+imaging+system+for+automated+analyses+of+avoidance+behavior+in+zebrafish+larvae.">A novel high-throughput imaging system for automated analyses of avoidance behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 223, 135-144 (2011).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+developmental+toxicity+by+automated+analyses+of+behavior+in+zebrafish+larvae.">Assessment of developmental toxicity by automated analyses of behavior in zebrafish larvae.</a> Unpublished observations. , (2012).</li><li>Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+edge:+pharmacological+evidence+for+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Behav. Brain Res. 228, 99-106 (2012).</li><li>Richendrfer, H. A., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+sub-chronic+exposure+to+chlorpyrifos+reduces+anxiety-related+behavior+in+zebrafish+larvae.">Developmental sub-chronic exposure to chlorpyrifos reduces anxiety-related behavior in zebrafish larvae.</a> Neurotoxicol. Teratol. , (2012).</li><li>Egan, R. J., Bergner, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish.">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behav. Brain Res. 205, 38-44 (2009).</li><li>Colwill, R., Creton, R., Kalluef, A., Stewart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish protocols for neurobehavioral research. 66, (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בעוד אנו שיפור assay התנהגותי הרומן שלנו ללא הרף, זה תמיד היה שימושי לזיהוי של הימנעות והתנהגות thigmotaxis בזחלי דג הזברה 15. ניסויים רבים בוצעו כדי לייעל את התוצאות של assay, כגון צבע של גירוי בשימוש, מספר האידיאלי של זחלים לכל נתיב, ואורך של assay התנהגותית. בעבר, השתמשנו בצלחות רב היטב (עם 6 או 12 בארות) 15,17,18. עם זאת, לאחרונה יצרנו את תבנית נתיב הרומן ליצור מרחב שחייה גדול יותר לזחלים ומאפשרים לנו לאסוף מספר גדול יותר של אמצעים התנהגותיים בassay אחת 16 (איור 5). שינויים נוספים כוללים וריאציות של שהעל&quot;ל המוצג PowerPoint (תנועה או אורך שונים של assay) ואת הגודל של הנתיבים בשימוש (יש לנו גם תבניות לסמטאות צרות יותר). נכון לעכשיו, מערכת האוטומטית של תפוקה גבוהה זה היא ייחודית ביכולתו למדוד מגוון רחב של התנהגויות בzebrזחלי afish באותו הזמן, כגון מהירות, הימנעות, קרבה לזחלים אחרים, וthigmotaxis בצלחות רב נתיבים. ניתן להשיג תוצאות במהירות ובמספר גדול של זחלים ניתן לנתח בזמן ההדמיה. המערכת היא גם זולה לבנות ומהירה וקלה להתקנה. מגבלה של שיטה זו היא שלא ניתן להעריך את תנועות 3-D בזחלי דג הזברה. מערכות אוטומטיות העוקבות אחר דג הזברה מבוגר שיש לו את יכולת 3-D וניתן לזהות מגוון רחב יותר של התנהגויות כגון תנועה למעלה או למטה בעמודת המים 10,19. מגבלה נוספת היא שמערכת ההדמיה שלנו כיום אינה מותאמת לניתוחי תפוקה גבוהה במהירות וידאו. ההדמיה מהירות וידאו אפשרית בעת הגדרת המצלמה לרזולוציה נמוכה יותר 15, אבל זה מגביל את הניתוח לצלחת אחת. בשימוש בשיטה חדש שנוצרה &quot;הנתיב&quot;, כמה חלקים של assay צריכים להיות מוצאים להורג באופן מדויק. כאשר מניחים את הזחלים בtהוא נתיבים, זה הוא קריטי כדי לוודא את רמת הנוזל היא מאוד רדודה עד שהצלחות ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אם הנתיבים מלאים מדי של נוזל, הזחלים יהיו להימלט אל שולי הצלחת. בנוסף, בעת הכנסת התבנית לתוך agarose, יש להקפיד להוריד את התבנית באיטיות רבה. אם העובש מוכנס במהירות רבה מדי, בועות יהוו בagarose ותזוהינה על ידי מאקרו J התמונה כזחלים נוספים. מומלץ כי אם יש לי נתיבי agarose אפילו כמה בועות, עדיף לעשות חדשות. בעתיד, ברצוננו לייעל את assay ההתנהגות שלנו לנתח התנהגויות אחרות מורכבות כגון למידה בזחלי דג הזברה ולבחון כיצד למידה יכולה להיות מושפעת מחשיפה לרעלים ותרופות בשלבי פיתוח מוקדם. אנחנו עובדים כרגע על מבחני שעשויות להיות שימושית לניתוח התנהגות למידה בה את התוצאות התנהגותיות עשויות להקל על קביעה אילו אזורים במוח הםמושפע toxicants או תרופות מסוימים במהלך פיתוח. מבחני אוטומטיים פותחו למדידת למידת התנהגויות בדג זברת זחלים 20 ומבחנים אלה עשויים להיות amendable להקרנת תפוקה גבוהה על ידי שימוש בתגובת ההימנעות החזקה בצלחות רב נתיבים. אנו מציעים כי התנהגות assay זה יכול לשמש במחקרים עתידיים לבדיקת ההשפעות התפתחותיות של מספר רב של תרופות וtoxicants. מחקרים מסוג זה מספקים שפע של מידע על גורמי סיכון ספציפיים ולתרום לקביעת הנחיות בטיחות ובריאות טובות יותר לנשים בהריון וילדים.

דג הזברה הופכת מודל פופולרי למדעים גנטיים, התפתחותי והתנהגותי 1-4. הם בוקעים מchorions על ידי לאחר הפריה ימים 2-3 (DPF), לפתח באופן מלא על ידי איברים מתפקדים DPF 4-5, ולהציג מספר גדול של התנהגויות של 7 DPF 5,6. זחלי דג הזברה מתאימים בצורה אידיאלית לניתוחי תפוקה גבוהה בגלל הגודל הקטן שלהם 7,8. תוכנה זמינה מסחרי עבור ניתוחים אוטומטיים של התנהגות בדג זברת הזחל ומבוגר 9-14. עם זאת, תוכנה זו יכולה להיות יקרה ויש לו אפשרויות מוגבלות למדידת התנהגויות מורכבות של זחלי דג הזברה בצלחות רב כן. יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה רומן שהיא זול להקמה ויכול לכמת את מספר ההתנהגויות שונות ב7 זחלי דג הזברה DPF 15,16. המערכת מאפשרת לנו לבחון במהירות וביעילות הפרעות התנהגותיות עדינות לאחר חשיפה עוברית למספרתרופות וtoxicants סביבתי 16-18. המערכת נבנתה באמצעות ארונות מעץ, שבית מצלמה דיגיטלית בחלק העליון של הארון. המצלמה פונה כלפי מטה אל החלק התחתון של הארון שבו מחשב נייד ממוקם עם המסך כלפי מעלה 15. זמן לשגות הדמיה משמשת כדי ללכוד את המיקום של הזחלים בסמטאות. זחלים יכולים להיות שוכנו בעד ארבע צלחות רבת או רב גם מסלולים אשר ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אנו משתמשים במצגת PowerPoint כגירוי מרתיע כדי שהזחלים להגיב על ידי מתרחק (הימנעות) ושוחה לכיוון הקצה (thigmotaxis) 15,17. את התמונות מיובאות לImageJ הבמשמש מאקרו אוטומטי לפצל את ערוצי הצבע, לחסר רקע, ולהחיל את סף לזהות זחלי פרט. קואורדינטות רשומות לכל זחל בכל תמונה ויכולות להיות מוכנסת לתוך קובץ Excel שבו אנו משתמשים כדי לכמת והימנעות thigmotaהתנהגות xis, דגים למרחק דגים, לשחות במהירות, וסכום של מנוחה 16.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>198262</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>That Pet Place</td>
			<td>214325</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>One well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-493</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital camera</td>
			<td>Canon </td>
			<td>EOS Rebel T1i</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Imaging Cabinets</td>
			<td>WoodCraft Towers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Laptops</td>
			<td>Acer Aspire</td>
			<td>Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera Lens</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic diffuser</td>
			<td>Pendaflex </td>
			<td>52345</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PowerPoint 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Excel 2010</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Statistical software</td>
			<td>SPSS 20</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

automated high-throughput behavioral analyses in zebrafish larvae

יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה חדשנית לניתוח התנהגות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת בצלחות רב נתיבים. מערכת זו מודדת התנהגויות ספונטניות והתגובה לגירוי מרתיע, אשר מוצגת לזחלים באמצעות מצגת PowerPoint. את התמונות שתועדו מנותחות עם מאקרו ImageJ, אשר באופן אוטומטי מחלק את ערוצי הצבע, מחסיר את הרקע, וחל סף לזהות מיקום זחלים בודד בסמטאות. אז אנחנו יכולים לייבא את הקואורדינטות לגיליון Excel לכמת מהירות השחייה, העדפה לקצה או בצד של הנתיב, התנהגות מנוחה, thigmotaxis, מרחק בין זחלים, והתנהגות הימנעות. שינויים קלים בהתנהגות מזוהים בקלות באמצעות המערכת שלנו, מה שהופך אותו לשימושי עבור ניתוחים התנהגותיות לאחר חשיפה לרעלים או תרופות סביבתיים.

במבחנים הקודמים שלנו, תוך שימוש בגירוי מרתיע הכדור המקפץ, זחלי סוג בר שהמטופל מגיבים לכדור לנוע על ידי שהלך לשחות ב( התנהגות ההימנעות) וגם לכיוון הקצוות (התנהגות thigmotaxis) 15 כן. מאוחר יותר אנו מאשרים כי התנהגות thigmotaxis בassay זה היא מדד של התנהגות הקשורה לחרדה בזחלי דג הזברה 17. היו הבדלים משמעותיים בתנועת הזחלים הרחק מכדור וההעדפה לקצה בהשוואה לרקע הלבן הריק. התנהגויות אלו גם אושרו בבדיקה החדשה שלנו באמצעות הסרגל האדום המרגש והם אפילו יותר חזקים 16. יתר על כן, כעת אנו יכולים לדגום מספר גדול יותר של התנהגויות בassay בודד כולל מהירות השחייה, מנוחה, העדפה לסוף או בצד של הבאר, ומרחק בין דגים (איור 5). זחלי בקרה גדלו במי ביצה מראים העדפה מוגברת להיות למטה בצלחת ועל קצה השבילחרה שהם מוצגים עם גירוי מרתיע (נע פס אדום). תוצאות דומות מתקבלות כאשר זחלים גדלים במי ביצה המכילים 1 מיקרוגרם / מיליליטר DMSO, ממס המשמש בדרך כלל להמסת תרופות וtoxicants שונים כ1,000 פתרונות מניות X. נציג תוצאות מוצגות באיור 5 בזחלי מטופלים עם ביצת מים וDMSO (כקבוצת ביקורת) וריכוזים שונים של חומרי הדברה organophosphate הנפוצים במזונות שאינם אורגניים. התוצאות המוצגות הן דגימה מניסוי אחד. עם זאת, כאשר חזרו, התוצאות מצביעות על כך שמהירות השחייה והתנהגות thigmotaxis משתנה על ידי ריכוזים נמוכים של חומרי ההדברה organophosphate, המחקים את הרמות בצריכת מזון אנושית 18. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig1.jpg" /> איור 1. מגשי אוסף. מנות פיירקס זכוכית משמשים לאיסוף דוארmbryos מהטנקים הדגים הבוגרים. מכסים מצלחות פיירקס נחתכו ונוסף עם רשתות פלסטיק וחוט ירוק שנתפרו על גבי הרשתות בפלסטיק. זה יוצר אווירה פורה לדג הזברה המבוגר על ידי חיקוי הסביבה הטבעית. <img alt="איור 2" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig2highres.jpg" fo:width="6in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig2.jpg" /> איור 2. תבנית פלסטיק ונתיבי agarose. א) העובש מוצג בצד השמאל. 0.8% agarose הוא שפך לתוך צלחת אחת היטב; העובש מוכנס לאט ולאחר מכן הוסר כאשר agarose מתקררת ב &#39;) את הצלחת על ימין מראה את הנתיבים שנוצרו בagarose ידי תבנית הפלסטיק.. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig3.jpg" /> איור 3. ארונות הדמיה. ארונות הדמיה היו specially שנבנה במעבדה שלנו ומשמש לניתוחים התנהגותיים תפוקה גבוהה. מצלמה 15 מגה פיקסל דיגיטלית הייתה מחוברת לחלקו העליון של הארון פונה כלפי מטה על מנת לאסוף תמונות זמן לשגות של הזחלים בצלחות multilane ממוקמות על גבי המסך של מחשב נייד. בין הצלחות והמסך יש מפזר פלסטיק שמשמש למניעת דפוסי moiré בתמונות שנאספו. <img alt="איור 4" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig4highres.jpg" fo:width="4.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig4.jpg" /> איור 4. רקע ריק וגירוי מרתיע-PowerPoint. זוהי PowerPoint הנוכחי המשמש כדי לעורר שינויים התנהגותיים בזחלי דג הזברה. הוא מספק בדלים התנהגותיים בין חזקים) רקע ריק ו-B) בר האדום המרגש. <img alt="איור 5" fo:content-width="/files/ftp_upload/50622/50622fig5highres.jpg" fo:width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50622/50622fig5.jpg" /> איור 5. התנהגויות לכמת בassay התפוקה גבוהה. דוגמה להתנהגויות שהם לכמת מassay ההתנהגות שלנו בתוך גיליון Excel שאנו משתמשים עבור x, y קואורדינטות של הזחלים. את הסורגים הלבנים מראים מידע מזחלים שנחשפו לרקע ריק ואת הקווים האדומים מראים מידע מהזחלים נחשפו לבר המרגש האדום ב- PowerPoint. הגרפים מראים את המדידות שניתן להשיג מניתוח התנהגות) אחוז הזחלים למטה בנתיב &#39;, ב&#39;) אחוז הזחלים בסוף השביל, C) אחוז הזחלים בקצה השביל, ד) מרחק בין דגים (מ&quot;מ), E) לשחות מהירות של אחוז שאר זחלי הזחלים (מ&quot;מ / דקה), F). בגרפים מוצגים, הנתונים הוא מtreatmאף אוזן גרון של זחלים עם DMSO שליטה וכמה ריכוזים של חומרי הדברה החל .001-0.1 מיקרומטר (רמות הנפוצות בתזונת האדם). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50622/50622fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

automated-high-throughput-behavioral-analyses-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K Views.  Brown University. המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

Video: Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to a certain degree, many animals have to be analyzed, to obtain statistically significant data. This in turn requires a computer assisted automated quantification of locomotion patterns. To obtain high contrast images of almost translucent and small moving objects, a novel imaging technique based on frustrated total internal reflection called FIM was developed. In this setup, animals are only illuminated with infrared light at the very specific position of contact with the underlying crawling surface. This methodology results in very high contrast images. Subsequently, these high contrast images are processed using established contour tracking algorithms. Based on this, we developed the FIMTrack software, which serves to extract a number of features needed to quantitatively describe a large variety of locomotion characteristics. During the development of this software package, we focused our efforts on an open source architecture allowing the easy addition of further modules. The program operates platform independent and is accompanied by an intuitive GUI guiding the user through data analysis. All locomotion parameter values are given in form of csv files allowing further data analyses. In addition, a Results Viewer integrated into the tracking software provides the opportunity to interactively review and adjust the output, as might be needed during stimulus integration. The power of FIM and FIMTrack is demonstrated by studying the locomotion of Drosophila larvae.

FIM is a novel, cost effective imaging system designed to track small moving objects such as C. elegans, planaria or Drosophila larvae. The accompanying FIMTrack program is designed to deliver fast and efficient data analysis. Together, these tools allow high-throughput analysis of behavioral traits.

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the surface of the cornea, electrical activity generated in response to light can be measured and used to assess the activity of retinal cells in vivo. This manuscript describes the use of the ERG to measure visual function in zebrafish. Zebrafish have long been utilized as a model for vertebrate development due to the ease of gene suppression by morpholino oligonucleotides and pharmacological manipulation. At 5-10 dpf, only cones are functional in the larval retina. Therefore, the zebrafish, unlike other animals, is a powerful model system for the study of cone visual function in vivo. This protocol uses standard anesthesia, micromanipulation and stereomicroscopy protocols that are common in laboratories that perform zebrafish research. The outlined methods make use of standard electrophysiology equipment and a low light camera to guide the placement of the recording microelectrode onto the larval cornea. Finally, we demonstrate how a commercially available ERG stimulator/recorder originally designed for use with mice can easily be adapted for use with zebrafish. ERG of larval zebrafish provides an excellent method of assaying cone visual function in animals that have been modified by morpholino oligonucleotide injection as well as newer genome engineering techniques such as Zinc Finger Nucleases (ZFNs), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, all of which have greatly increased the efficiency and efficacy of gene targeting in zebrafish. In addition, we take advantage of the ability of pharmacological agents to penetrate zebrafish larvae to evaluate the molecular components that contribute to the photoresponse. This protocol outlines a setup that can be modified and used by researchers with various experimental goals.

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

ניתוח electroretinogram של התגובה החזותית בדג הזברה זחלים

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

ניתוח התנהגותי ופיזיולוגי במודל דגי זברה של אפילפסיה

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

באמצעות הזחלים Zebrafish ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של שבץ מדמם

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This alternate immersion protocol is a noninvasive, step-wise method of inducing hyperglycemia for up to eight weeks. Adult zebrafish are alternately exposed to sugar (glucose) and water for 24 hours each. The zebrafish begin treatment in a 1% glucose solution for 2 weeks, then a 2% solution for 2 weeks, and finally a 3% solution for the remaining 4 weeks. Compared to water-treated (stress) and mannitol-treated (osmotic) controls, glucose-treated zebrafish have significantly higher blood sugar levels. The glucose-treated zebrafish show blood sugar levels of 3-times that of controls, suggesting that after both four and eight weeks hyperglycemia can be achieved. Sustained hyperglycemia was associated with increased Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and increased nuclear factor Kappa B (NF-kB)&#160;levels in retina and decreased physiological responses, as well as cognitive deficits suggesting this protocol can be used to model disease complications.

This protocol noninvasively induces hyperglycemia in zebrafish for up to 8 weeks. Using this protocol, an in-depth study of the adverse effects of hyperglycemia can be made.

טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. Establishment of the EcoHIV infected rat model for studies of drug abuse and neurocognitive disorders, would be beneficial in the study of neuroHIV and HIV-1 associated neurocognitive disorders (HAND). In the present study, we demonstrate the successful creation of a rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV). First, the lentiviral construct of EcoHIV was packaged in cultured 293 FT cells for 48 hours. Then, the conditional medium was concentrated and titered. Next, we performed bilateral stereotaxic injections of the EcoHIV-EGFP into F344/N rat brain tissue. One week after infection, EGFP fluorescence signals were detected in the infected brain tissue, indicating that EcoHIV successfully induces an active HIV infection in rats. In addition, immunostaining for the microglial cell marker, Iba1, was performed. The results indicated that microglia were the predominant cell type harboring EcoHIV. Furthermore, EcoHIV rats exhibited alterations in temporal processing, a potential underlying neurobehavioral mechanism of HAND as well as synaptic dysfunction eight weeks after infection. Collectively, the present study extends the EcoHIV model of HIV-1 infection to the rat offering a valuable biological system to study HIV-1 viral reservoirs in the brain as well as HAND and associated comorbidities such as drug abuse.

Here, we present a protocol to establish a new rat model of active HIV infection using chimeric HIV (EcoHIV), which is critical for enhancing our understanding of HIV-1 viral reservoirs in the brain and offering a system to study HIV-associated neurocognitive disorders and associated comorbidities (i.e., drug abuse).

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

מעבר שלב אופטוגנטי של TDP-43 בתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה של זחלי דגי זברה

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

מחבר זרקור: In Vivo הדמיה של המוח כולו של זחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

ב Vivo הדמיה מוחית שלמה של זחלי דגי זברה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תלת מימדי

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...