פרוטוקול זה הוא שיטה קלה להפחתת polydispersity של טיפות vaporizable נקודת רתיחה נמוכה לשימוש ביישומים ביו-רפואיים. טכניקה זו מעיבה מיקרו-חלוקי גז מעוצבים ומסננת את הטיפות הנוזליות המתקבלות לפי גודלן באופן שניתן לשלוט בהן, מדרגיות וחסכוני יחסית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של microbubbles שומנים עם פגז שונים וחומר גז באמצעות מסננים שונים כדי לשלוט בגודל טיפה סופית.
מי שתדגים את ההליך תהיה דארה מרילאט, חוקרת לתואר ראשון במעבדתו של ד"ר סירסי. הפעל את מתג ההפעלה עבור sonicator, והגדר את המשרעת למקסימום המותר באמצעות הקובץ המצורף microtip, ולהבטיח זמן sonication מוגדר ל 10 שניות. מניחים את תמיסת השומנים החם במתחם הקול עם המיקרו-קצה ממש מתחת לפני השטח.
חבר אורך מתאים של צינורות לצוואר של הקרבון כדי להנחות את הגז משקע טנק DFB לתוך תמיסה שומנים חמים המוחזק במתחם. פתח את שסתום המיכל לאט עד שניתן לראות את הגז זורם מעל תמיסה השומנים, גרימת גלים קלים על פני השטח של הנוזל. אם זרימת הגז גבוהה מדי, הפתרון יעלה על גדותיו במהלך היווצרות חלוקי מיקרו.
הפעל את sonicator, ולהפעיל אותו במשך 10 שניות ברציפות כדי ליצור microbubbles. לאחר sonication נגמר, מיד לסגור את שסתום טנק DFB. מכסים במהירות את תמיסת המיקרו-חלוק, ומטביעים את הנקניקיון באמבט קרח כדי לקרר את המדגם מתחת ל-55 מעלות צלזיוס.
השתמש מסנן קרמיקה 200 ננומטר כדי להרכיב את מכבש בלחץ גבוה על פי המדריך של המשתמש, ומניח אותו במרכז מיכל אטום למים, כך צינור שקע מדגם לא נלחץ נגד הצד, או קמט. צמד את המהלל למיכל גז חנקן באמצעות המתאם שסופק על ידי היצרן. מניחים את קצה צינור השקע בלוויינית נוצצת כדי לאסוף את הדגימה המובלטת, ומאבטחים את הצינור למיכל עם סרט הדבקה כדי להישאר בתוך הוויאל.
פתח וסגור את שסתום השחרור כדי להבטיח שאין לחץ בתוך המהלל. הסר את מכסה התא. ולהוסיף חמישה מיליליטר של PBS לתא המהלל.
החלף את המכסה, ודא שהוא לוחץ בבטחה בחזרה למקומו. פתח את מיכל הגז חנקן, כך מד הלחץ קורא 250 PSI, מוודא שסתום בקרת הלחץ הוא במצב סגור. סגור את מיכל הדלק, ופתח את שסתום הכניסה של תא ההצצה, מה שגורם לתמיסת PBS להידחף דרך המערכת, ולהוציא את צינור שקע הדגימה לתוך מטען הניצוצות.
כאשר רק גז יוצא הצינורות, לפתוח את שסתום השחרור, ולאפשר ללחץ ליפול לאפס PSI. ואז להסיר את מבחן הניצוץ. פתח וסגור את שסתום השחרור כדי לוודא שאין לחץ בתוך המהלוך, ולהניח מקטורן נוצץ חדש בקצה צינור השקע.
מלא מיכל פלדה עם 2-מתילבוטן, ולהוסיף קרח יבש כדי להוריד את הטמפרטורה למינוס 18 מעלות צלזיוס. הכנס את פתרון microbubble לתוך 2-מתילבוטן צונן, שקוע המדגם במשך שתי דקות. הזז את מילון הניקוד לאורך שתי הדקות כדי לערבב בעדינות את הבועות.
מוסיפים קרח יבש לפי הצורך כדי לשמור על הטמפרטורה בין מינוס 15 למינוס 18 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות, להסיר את microbubbles מן 2-מתילבוטן צונן. מערבבים בעדינות את המיקרו-בועות ומעבירים בועות למזרק צונן של 10 מיליליטר.
הסר את מכסה תא extruder, ולהוסיף את פתרון microbubble לתא על ידי לחיצה איטית על הבוכנה על המזרק. החלף את מכסה ההפרש, ודא שהוא לוחץ בצורה מאובטחת במקום. ודא כי שסתום בקרת הלחץ ואת שסתום השחרור של extruder נמצאים במצב סגור.
פתח את מיכל הדלק של החנקן עד שמד הלחץ יקרא 250 PSI. סגור את מיכל הדלק, ולהפוך את שסתום בקרת הלחץ למיקום הפתוח. כאשר הפתרון מילא את מקטורן הניצוצים בצינורות היציאה ורק גז יוצא מהצינור, פתח לאט את שסתום שחרור הלחץ, ואפשר ללחץ ליפול לאפס PSI.
העבר 10 מיליליטר של פתרון טיפה שחול לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. צנטריפוגה הדגימה המובלטת ב 1, 500 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את supernatant ואת טיפות התאדו באופן ספונטני המופיעים בחלק העליון של הפתרון.
להשעות מחדש את הכדור הכולל ננו-טיפות DFP ב 10 מיליליטר של PBS עם 20%גליצלול ו 20%פרופילן גליקול. התפלגות הגודל של פתרונות בועה מרוכזת עם ובלי שחול מראה כי המדגם המרוכז בלבד יש התפלגות רחבה בהרבה מרוכזת ליד 400 ננומטר, בעוד המדגם המובלט יש התפלגות צרה יותר מרוכזת ב 200 ננומטר. ניתוח חישת דופק התנגדות טונה המשמש לניתוח טיפות הזזת פאזה כפי שהם נשטפו על ידי צנטריפוגה כדי להסיר ליפוזומים עודפים מראה כי גדלי טיפה הם קרובים 200 ננומטר.
נתוני המיקרוסקופיה של אידוי ננו-טיפות כאשר מחומם מראים כי כמה microbubbles התאדו באופן ספונטני ניכרים בשדה הראייה לפני החימום, ומספר גדול יותר של microbubbles גז נצפים לאחר חימום. תמונות המיקרוסקופיה של ננו-טיפות מוכנסות למחשוף ישירות ללא קירור מראש, מרוכזות באפס מעלות צלזיוס, ובמינוס 18 מעלות צלזיוס מוצגות כאן. תמונות מייצגות של טיפות אוקטפלואורורופפן מרוכזות לפני ואחרי אידוי מראות גם מספר גדול יותר של מיקרו-חלוקי גז לאחר החימום, בדומה לטפתיות DFB.
הדבר החשוב ביותר לזכור במהלך הליך זה הוא כי תפוקת טיפה תלויה מאוד בטמפרטורה והלחץ במהלך עיבוי, וריאציות קלות ישפיעו על התוצאות. לאחר יצירת טיפות vaporizable, הם יכולים לשמש כדי לייעל הדמיה vivo ומשלוח סמים באמצעות אולטרסאונד, כמו גם אחרים in vivo ו ex vivo יישומים. לאחר פיתוח טכניקה זו, ההשפעות של גודל nanodroplet ותכולת ליבת הגז על סף אידוי ויואו נחקרו באמצעות שינויים קלים לפרוטוקול זה.
