Ce protocole est une méthode simple de réduction de la polydispersité des gouttelettes vaporisables à bas point d’ébullition pour une utilisation dans des applications biomédicales. Cette technique condense les microbulles de gaz préformées et filtre les gouttelettes liquides résultantes par taille d’une manière contrôlable, évolutive et relativement rentable. Cette méthode peut être appliquée à une variété de microbulles lipidiques avec différents matériaux de coquille et de gaz en utilisant différents filtres pour contrôler la taille finale des gouttelettes.
Darrah Merillat, une chercheuse de premier cycle du laboratoire du Dr Sirsi, fera la démonstration de la procédure. Allumez l’interrupteur d’alimentation du sonicator, réglez l’amplitude au maximum autorisé à l’aide de la fixation micro-embout et assurez-vous que le temps de sonication est réglé sur 10 secondes. Placez la solution lipidique hydratée chaude dans l’enceinte acoustique avec la micro-pointe juste sous la surface.
Fixez une longueur appropriée de tube au col du flacon pour guider le gaz de la sortie du réservoir DFB dans la solution lipidique chaude maintenue dans l’enceinte. Ouvrez lentement la vanne du réservoir jusqu’à ce que le gaz puisse être vu s’écouler sur la solution lipidique, provoquant de légères ondulations à la surface du liquide. Si le débit de gaz est trop élevé, la solution débordera lors de la formation de microbulles.
Démarrez le sonicator et faites-le fonctionner pendant 10 secondes en continu pour générer des microbulles. Une fois la sonication terminée, fermez immédiatement la vanne du réservoir DFB. Boucher rapidement la solution de microbulles et immerger le flacon dans un bain de glace pour refroidir l’échantillon en dessous de 55 degrés Celsius.
Utilisez un filtre en céramique de 200 nanomètres pour assembler l’extrudeuse haute pression conformément au manuel de l’utilisateur et placez-la au centre d’un récipient étanche, de sorte que le tube de sortie de l’échantillon ne soit pas pressé contre le côté ou serti. Couplez l’extrudeuse au réservoir d’azote gazeux à l’aide de l’adaptateur fourni par le fabricant. Placez l’extrémité du tube de sortie dans un flacon de scintillation pour prélever l’échantillon extrudé, en fixant le tube au récipient avec du ruban adhésif pour rester dans le flacon.
Ouvrez et fermez la soupape de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse. Retirez le couvercle de la chambre. Et ajoutez cinq millilitres de PBS à la chambre d’extrusion.
Remplacez le couvercle en vous assurant qu’il est bien remis en place. Ouvrez le réservoir d’azote gazeux, de sorte que le manomètre indique 250 PSI, en vous assurant que la soupape de contrôle de pression est en position fermée. Fermez le réservoir de gaz et ouvrez la vanne d’entrée de la chambre d’extrusion, ce qui entraîne la poussée de la solution PBS à travers le système et le tube de sortie de l’échantillon dans le flacon de scintillation.
Lorsque seul le gaz sort du tube, ouvrez la soupape de desserrage et laissez la pression tomber à zéro PSI. Retirez ensuite le flacon de scintillation. Ouvrez et fermez la vanne de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse et placez un nouveau flacon de scintillation à l’extrémité du tube de sortie.
Remplissez un récipient en acier avec du 2-méthylbutane et ajoutez de la glace carbonique pour ramener la température à moins 18 degrés Celsius. Insérez la solution de microbulles dans le 2-méthylbutane réfrigéré, en immergeant l’échantillon pendant deux minutes. Déplacez le flacon de scintillation pendant les deux minutes pour mélanger doucement les bulles.
Ajouter de la glace carbonique au besoin pour maintenir la température entre moins 15 et moins 18 degrés Celsius. Après deux minutes, retirez les microbulles du 2-méthylbutane réfrigéré. Faites tourbillonner doucement le flacon pour mélanger les microbulles et transférez les bulles dans une seringue réfrigérée de 10 millilitres.
Retirez le couvercle de la chambre d’extrusion et ajoutez la solution de microbulles à la chambre en poussant lentement le piston sur la seringue. Remplacez le capuchon de l’extrudeuse en vous assurant qu’il clique bien en place. Vérifiez que la vanne de régulation de pression et la vanne de desserrage de l’extrudeuse sont en position fermée.
Ouvrez le réservoir d’azote gazeux jusqu’à ce que le manomètre indique 250 PSI. Fermez le réservoir d’essence et tournez la vanne de régulation de pression en position ouverte. Lorsque la solution a rempli le flacon de scintillation au niveau du tube de sortie et que seul le gaz sort du tube, ouvrez lentement la soupape de décompression et laissez la pression tomber à zéro PSI.
Transférer 10 millilitres de la solution de gouttelettes extrudées dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifuger l’échantillon extrudé à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et les gouttelettes vaporisées spontanément apparaissant en haut de la solution.
Remettez en suspension la pastille comprenant des nanogouttelettes DFP dans 10 millilitres de PBS avec 20% de glycérol et 20% de propylène glycol. La distribution granulométrique des solutions de bulles condensées avec et sans extrusion montre que l’échantillon condensé seulement a une distribution beaucoup plus large centrée près de 400 nanomètres, tandis que l’échantillon extrudé a une distribution plus étroite centrée à 200 nanomètres. L’analyse de détection d’impulsion à résistance accordable utilisée pour analyser les gouttelettes de déphasage lorsqu’elles ont été lavées par centrifugation pour éliminer les liposomes en excès montre que la taille des gouttelettes est proche de 200 nanomètres.
Les données microscopiques de la vaporisation de nanogouttelettes lorsqu’elles sont chauffées montrent que certaines microbulles vaporisées spontanément sont apparentes dans le champ de vision avant le chauffage, et qu’un plus grand nombre de microbulles de gaz sont observées après le chauffage. Les images microscopiques de nanogouttelettes insérées dans l’extrudeuse directement sans pré-refroidissement, condensées à zéro degré Celsius et à moins 18 degrés Celsius sont montrées ici. Des images représentatives de gouttelettes d’octafluoropropane condensées avant et après la vaporisation montrent également un plus grand nombre de microbulles de gaz après chauffage, similaires aux gouttelettes DFB.
La chose la plus importante à retenir au cours de cette procédure est que le rendement en gouttelettes dépend fortement de la température et de la pression pendant la condensation, et de légères variations auront un impact sur les résultats. Après avoir généré des gouttelettes vaporisables, ils peuvent être utilisés pour optimiser l’imagerie in vivo et l’administration de médicaments à l’aide d’ultrasons, ainsi que d’autres applications in vivo et ex vivo. Après avoir mis au point cette technique, les effets de la taille des nanogouttelettes et de la teneur en noyau de gaz sur les seuils de vaporisation in vivo ont été explorés en apportant de légères modifications à ce protocole.
