Questo protocollo è un metodo semplice per ridurre la polidispersità di goccioline vaporizzabili a basso punto di ebollizione per l'uso in applicazioni biomediche. Questa tecnica condensa microbolle di gas preformate e filtra le goccioline liquide risultanti per dimensione in modo controllabile, scalabile e relativamente conveniente. Questo metodo può essere applicato a una varietà di microbolle lipidiche con diverso guscio e materiale gassoso utilizzando diversi filtri per controllare la dimensione finale delle goccioline.
A dimostrare la procedura sarà Darrah Merillat, ricercatrice universitaria del laboratorio del Dr.Sirsi. Accendere l'interruttore di alimentazione per il sonicatore e impostare l'ampiezza sul massimo consentito utilizzando l'attacco microtip e garantire che il tempo di sonicazione sia impostato su 10 secondi. Posizionare la soluzione lipidica idratata calda nell'involucro sonoro con il microtip appena sotto la superficie.
Fissare una lunghezza appropriata del tubo al collo del flaconcino per guidare il gas dall'uscita del serbatoio DFB alla soluzione lipidica calda contenuta nell'involucro. Aprire lentamente la valvola del serbatoio fino a quando il gas può essere visto scorrere sopra la soluzione lipidica, causando lievi increspature sulla superficie del liquido. Se il flusso di gas è troppo alto, la soluzione traboccherà durante la formazione di microbolle.
Avviare il sonicatore ed eseguirlo per 10 secondi ininterrottamente per generare microbolle. Al termine della sonicazione, chiudere immediatamente la valvola del serbatoio DFB. Chiudere rapidamente la soluzione di microbolle e immergere il flaconcino in un bagno di ghiaccio per raffreddare il campione al di sotto dei 55 gradi Celsius.
Utilizzare un filtro ceramico a 200 nanometri per assemblare l'estrusore ad alta pressione secondo il manuale dell'utente e posizionarlo al centro di un contenitore a tenuta stagna, in modo che il tubo di uscita del campione non venga premuto contro il lato o crimpato. Accoppiare l'estrusore al serbatoio del gas azoto utilizzando l'adattatore fornito dal produttore. Posizionare l'estremità del tubo di uscita in un flaconcino a scintillazione per raccogliere il campione estruso, fissando il tubo al contenitore con del nastro adesivo per rimanere all'interno del flaconcino.
Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore. Rimuovere il coperchio della camera. E aggiungi cinque millilitri di PBS alla camera dell'estrusore.
Sostituisci il coperchio, assicurandoti che torni saldamente in posizione. Aprire il serbatoio del gas azoto, in modo che il manometro legga 250 PSI, assicurandosi che la valvola di controllo della pressione sia in posizione chiusa. Chiudere il serbatoio del gas e aprire la valvola di ingresso della camera dell'estrusore, facendo sì che la soluzione PBS venga spinta attraverso il sistema e fuoriesca il tubo di uscita del campione nel flaconcino di scintillazione.
Quando solo il gas esce dal tubo, aprire la valvola di rilascio e lasciare che la pressione scenda a zero PSI. Quindi rimuovere il flaconcino di scintillazione. Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore e posizionare un nuovo flaconcino di scintillazione all'estremità del tubo di uscita.
Riempire un contenitore di acciaio con 2-metilbutano e aggiungere ghiaccio secco per portare la temperatura a meno 18 gradi Celsius. Inserire la soluzione di microbolle nel 2-metilbutano refrigerato, immergendo il campione per due minuti. Spostare il flaconcino di scintillazione per tutti i due minuti per mescolare delicatamente le bolle.
Aggiungere ghiaccio secco secondo necessità per mantenere la temperatura tra meno 15 e meno 18 gradi Celsius. Dopo due minuti, rimuovere le microbolle dal 2-metilbutano refrigerato. Ruotare delicatamente il flaconcino per mescolare le microbolle e trasferire le bolle in una siringa refrigerata da 10 millilitri.
Rimuovere il coperchio della camera dell'estrusore e aggiungere la soluzione di microbolle alla camera spingendo lentamente lo stantuffo sulla siringa. Sostituire il cappuccio dell'estrusore, assicurandosi che faccia clic in modo sicuro in posizione. Verificare che la valvola di controllo della pressione e la valvola di rilascio dell'estrusore siano in posizione chiusa.
Aprire il serbatoio del gas azoto fino a quando il manometro legge 250 PSI. Chiudere il serbatoio del gas e ruotare la valvola di controllo della pressione in posizione aperta. Quando la soluzione ha riempito il flaconcino di scintillazione nel tubo di uscita e solo il gas esce dal tubo, aprire lentamente la valvola di rilascio della pressione e lasciare che la pressione scenda a zero PSI.
Trasferire 10 millilitri della soluzione di goccioline estruse in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Centrifugare il campione estruso a 1.500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e le goccioline vaporizzate spontaneamente che appaiono nella parte superiore della soluzione.
Sospendere nuovamente il pellet composto da nanogoccioline DFP in 10 millilitri di PBS con il 20% di glicerolo e il 20% di glicole propilenico. La distribuzione dimensionale delle soluzioni a bolle condensate con e senza estrusione mostra che il campione condensato solo ha una distribuzione molto più ampia centrata vicino a 400 nanometri, mentre il campione estruso ha una distribuzione più stretta centrata a 200 nanometri. L'analisi di rilevamento degli impulsi di resistenza sintonizzabile utilizzata per analizzare le goccioline a sfasamento mentre sono state lavate mediante centrifugazione per rimuovere i liposomi in eccesso mostra che le dimensioni delle goccioline sono vicine a 200 nanometri.
I dati al microscopio della vaporizzazione delle nanogoccioline quando riscaldate mostrano che alcune microbolle vaporizzate spontaneamente sono evidenti nel campo visivo prima del riscaldamento e un numero maggiore di microbolle di gas si osservano dopo il riscaldamento. Le immagini al microscopio di nanogoccioline inserite nell'estrusore direttamente senza pre-raffreddamento, condensate a zero gradi Celsius e a meno 18 gradi Celsius sono mostrate qui. Immagini rappresentative di goccioline di ottafluoropropano condensato prima e dopo la vaporizzazione mostrano anche un numero maggiore di microbolle di gas dopo il riscaldamento, simili alle goccioline DFB.
La cosa più importante da ricordare durante questa procedura è che la resa delle gocce dipende fortemente dalla temperatura e dalla pressione durante la condensazione e lievi variazioni influenzeranno i risultati. Dopo aver generato goccioline vaporizzabili, possono essere utilizzate per ottimizzare l'imaging in vivo e la somministrazione di farmaci utilizzando gli ultrasuoni, nonché altre applicazioni in vivo ed ex vivo. Dopo aver sviluppato questa tecnica, gli effetti della dimensione delle nanogoccioline e del contenuto del nucleo di gas sulle soglie di vaporizzazione in vivo sono stati esplorati utilizzando lievi modifiche a questo protocollo.
