이 프로토콜은 생체 의학 응용 분야에서 사용하기 위해 낮은 비등점 vaporizable 방울의 다분산성을 감소시키는 쉬운 방법입니다. 이 기술은 미리 형성된 가스 마이크로 버블을 응축시키고 제어 가능하고 확장 가능하며 비교적 비용 효율적인 방식으로 생성된 액체 방울을 크기별로 필터링합니다. 이 방법은 최종 액적 크기를 제어하기 위해 다른 필터를 사용하여 다른 쉘 및 가스 물질을 가진 다양한 지질 마이크로 버블에 적용 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 박사 선생님시 연구소의 학부 연구원 인 Darrah Merillat가 될 것입니다. 초음파 처리기의 전원 스위치를 켜고 마이크로팁 부착을 사용하여 허용된 최대로 진폭을 설정하고 초음파 처리 시간을 10초로 설정하도록 합니다. 따뜻한 수화 지질 용액을 사운드 인클로저에 미세 팁이 있는 표면 아래에 놓습니다.
DFB 탱크 출구에서 인클로저에 보관된 따뜻한 지질 용액으로 가스를 안내하기 위해 유리병 목에 적절한 튜브 길이를 부착합니다. 가스가 지질 용액 위로 흐르는 것을 볼 수 있을 때까지 탱크 밸브를 천천히 열어 액체 표면에 약간의 파문을 일으킵니다. 가스 흐름이 너무 높으면 마이크로 버블 형성 중에 용액이 넘쳐납니다.
초음파 처리기를 시작하고 10 초 동안 계속 실행하여 마이크로 버블을 생성합니다. 초음파 처리가 끝나면 DFB 탱크 밸브를 즉시 닫습니다. 마이크로 버블 용액을 빠르게 캡을 씌우고 얼음 욕조에 유리병을 담그고 샘플을 섭씨 55도 이하로 식힙니다.
200나노미터 세라믹 필터를 사용하여 사용자의 매뉴얼에 따라 고압 압출기를 조립하고 방수 용기의 중앙에 배치하여 샘플 콘센트 튜브가 측면에 대해 압착되거나 압착되지 않도록 합니다. 제조 자가 공급한 어댑터를 사용하여 압출기를 질소 가스 탱크에 결합하십시오. 압출 된 샘플을 수집하기 위해 출구 튜브의 끝을 반짝이 유리병에 넣고 유리병 내에 머물 기 위해 테이프로 용기에 튜브를 고정시하십시오.
방출 밸브를 열고 닫아 압출기 내에 압력이 없도록 합니다. 챔버 뚜껑을 제거합니다. 그리고 압출기 챔버에 PBS의 5 밀리리터를 추가합니다.
뚜껑을 교체하여 안전하게 다시 제자리에 클릭하는지 확인합니다. 압력 게이지가 250 PSI를 판독하도록 질소 가스 탱크를 열어 압력 제어 밸브가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다. 가스 탱크를 닫고 압출기 챔버 입구 밸브를 열어 PBS 용액이 시스템을 통해 밀어 내고 샘플 출구 튜브를 신자극 유리병으로 내쫓습니다.
가스만 튜브를 빠져나갈 때, 방출 밸브를 열고 압력이 PSI제로 떨어질 수 있습니다. 그런 다음 반짝이 유리병을 제거합니다. 방출 밸브를 열고 닫아 압출기 내에 압력이 없는지 확인하고 콘센트 튜브 끝에 새로운 반짝임을 배치합니다.
강철 용기를 2-메틸부탄으로 채우고 드라이 아이스를 추가하여 온도를 섭씨 영하 18도까지 떨어뜨리세요. 차가운 2-메틸부탄에 마이크로 버블 용액을 삽입하여 샘플을 2 분 동안 잠급니다. 2분 내내 반짝이는 바이알을 움직여 거품을 부드럽게 섞습니다.
영하 15도에서 영하 18도 사이의 온도를 유지하기 위해 필요에 따라 드라이 아이스를 추가합니다. 2 분 후, 차가운 2-메틸 부탄에서 마이크로 버블을 제거합니다. 유리병을 부드럽게 소용돌이어 마이크로버블을 섞고 거품을 차가운 10밀리리터 주사기로 옮춥니다.
압출기 챔버 뚜껑을 제거하고 주사기의 플런저를 천천히 밀어 챔버에 마이크로 버블 용액을 추가합니다. 압출기 캡을 교체하여 제자리에 안전하게 클릭합니다. 압출기의 압력 제어 밸브와 방출 밸브가 닫힌 위치에 있는지 확인합니다.
압력 게이지가 250 PSI를 읽을 때까지 질소 가스 탱크를 엽니다. 가스 탱크를 닫고 압력 제어 밸브를 열린 위치로 돌립니다. 용액이 출구 튜브에서 신경병 바이알을 채우고 가스만 튜브를 빠져나가는 경우 압력 방출 밸브를 천천히 열고 압력이 PSI제로 떨어질 수 있습니다.
압출 된 액적 용액 10 밀리리터를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기십시오. 압출된 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 500회 G로 원심분리합니다. 솔루션 상단에 나타나는 상체와 자발적으로 기화 된 방울을 버리십시오.
20%의 글리세롤과 20%의 프로필렌 글리콜을 갖춘 PBS의 10 밀리리터에서 DFP 나노방울을 포함하는 펠릿을 다시 중단한다. 압출 유무에 응축된 버블 솔루션의 크기 분포는 응축된 샘플만이 400나노미터에 가까운 분포를 훨씬 더 넓게 가지고 있는 반면, 압출된 시료는 200나노미터를 중심으로 분포가 좁아진 것을 보여준다. 상시변액을 분석하여 과도한 리포솜을 제거하기 위해 상시프트 액적을 분석하는 데 사용되는 튜닝 저항 펄스 감지 분석은 액적 크기가 200나노미터에 가깝다는 것을 나타낸다.
가열 시 나노방울 기화의 현미경 데이터는 일부 자발적으로 기화 된 마이크로 버블이 가열 전에 시야에서 명백하다는 것을 나타내며, 가열 후 더 많은 수의 가스 마이크로 버블이 관찰된다. 사전 냉각 없이 압출기에 직접 삽입된 나노방울의 현미경 이미지는 섭씨 0도에서 응축되고 영하 18도에서 여기에 표시됩니다. 기화 전후에 응축된 옥타플루오로프로판 방울의 대표적인 이미지는 DFB 액적과 유사한 가열 후 더 많은 수의 가스 마이크로버블을 보여줍니다.
이 절차 에서 기억해야 할 가장 중요한 것은 물방울 수율이 응축 중 온도와 압력에 크게 의존하며 약간의 변화가 결과에 영향을 미친다는 것입니다. 증발 가능한 물방울을 생성 한 후 초음파를 사용하여 생체 이미징 및 약물 전달뿐만 아니라 다른 생체 내 및 전 생체 응용 프로그램을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 개발 한 후, 생체 내 기화 임계값에 나노 방울 크기와 가스 코어 함량의 효과는이 프로토콜에 약간의 수정을 사용하여 탐구되었습니다.
