O presente protocolo pode servir como uma nova plataforma para o estudo e desenvolvimento de portadores de drogas para atingir locais de doenças dentro do sistema vascular humano. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite o estudo do acúmulo de portadores de drogas dentro do modelo arterial 3d replicado pelo homem. Isso é feito sob condições fisiológicas, incluindo o fluxo sanguíneo.
Essa abordagem pode ser usada para otimizar os portadores de medicamentos para o diagnóstico e tratamento de uma ampla gama de doenças vasculares, incluindo artérias ateroscleróticas. Comece selecionando imagens de pacientes ou geometrias previamente estudadas da bifurcação da artéria carótida humana e usando as imagens para criar um modelo de design auxiliado por computador do molde. Use uma impressora 3d para imprimir o design, remova os suportes temporários de impressão e enxágue o modelo com acetona antes de usar lixa para polir e suavizar os moldes, especialmente as áreas de onde os suportes foram cortados.
Depois de lixar, enxágue o modelo com álcool isopropílico para remover qualquer pó plástico e deixe o modelo secar em uma capa química por duas a três horas. Para facilitar a desilusão do plástico, pulverize o modelo com laca transparente três vezes, permitindo que a laca seque pelo ar por uma hora entre as aplicações. Após a última aplicação, use uma escova de tinta e laca para colar tiras transparentes e retangulares de plástico liso em cada lado da moldura, de tal forma que o modelo será selado na parte inferior e aberto na parte superior.
Após a secagem, coloque o molde em um desiccador e lentamente mal preparado solução de borracha de silicone recém-preparada na abertura. Remova as bolhas de ar até que a mistura esteja limpa e deixe o molde dentro do desiccator durante a noite. Quando a mistura estiver totalmente seca, remova as lâminas transparentes e mergulhe o modelo em acetona absoluta por 48 horas em uma capa química até que o plástico esteja totalmente dissolvido.
Para evaporar a acetona presa antes da semeadura celular, incubar o modelo por pelo menos quatro dias a 60 graus Celsius. Para semear o modelo com células, primeiro esterilize o modelo e dois conectores de entrada e saída por luz ultravioleta ou radiação. Após 20 minutos, utilizando uma seringa para revestir o modelo com quatro mililitros de 100 microgramas por mililitro fibronectina por duas horas a 37 graus Celsius.
No final da incubação, remova a solução de fibronectina através da tomada e lave o modelo com meio celular endotelial. Use uma seringa para encher o modelo enxaguado com quatro mililitros de uma 2,5 vezes 10 a sexta células endoteliais por mililitro de suspensão celular média endotelial e fixar o modelo a uma rotadora dentro de uma incubadora de cultura celular 48 horas a uma revolução por minuto, para garantir a distribuição homogênea das células. No final da incubação, use uma seringa plástica de 10 mililitros para lavar o modelo com PBS.
Fixar as células por 15 minutos, com quatro mililitros de 4% de paraformaldeído, depois lave o modelo três vezes com PBS como demonstrado antes de armazenar o modelo a quatro graus Celsius em quatro mililitros de PBS fresco. Antes de iniciar um experimento, use a tubulação de saída para conectar um amortecedor de oscilação conectado a uma bomba peristáltica à entrada do modelo carótida cultivado e use um pedaço de tubo para fundir as duas tomadas. Em seguida, divida a tubulação de saída em dois tubos de saída e adicione um grampo plástico a cada tubo.
Para configurar uma configuração de circuito fechado, adicione 300 mililitros de PBS a um recipiente de circuito fechado e coloque uma entrada e um tubo de saída dentro do recipiente cheio pbs com os grampos B e C abertos, respectivamente, em seguida, coloque o outro tubo de entrada em um recipiente de lavagem de um litro cheio de água destilada, e o outro tubo de saída em um recipiente vazio de um litro de resíduos com os grampos A e D fechados, respectivamente. Coloque o modelo carótida sob um microscópio estéreo, ajuste a bomba para uma taxa de fluxo inicial de 10 revoluções por minuto, com cinco aumentos de incremento por minuto a cada quatro a cinco minutos. Quando a taxa de fluxo atingir 100 rotações por minuto, adicione 1,6 microgramas de partículas fluorescentes de poliestireno carboxilado por mililitro de PBS ao contêiner de circuito fechado e exploda a região de interesse a cada 10 segundos por uma hora e meia.
Para configurar uma configuração de circuito aberto, abra os grampos A e D e feche imediatamente os grampos B e C. Deixe a maior parte da água fluir do recipiente de lavagem para o recipiente de resíduos a 100 revoluções por minuto. Antes que a água seja completamente transferida, pare a bomba e feche os grampos do tubo antes da entrada e após a saída do modelo carótida.
Utilizando os filtros apropriados, capture imagens do modelo na região de interesse para mostrar a deposição e a adesão das partículas às células. Após a conclusão do experimento, use um código de software personalizado para analisar as imagens capturadas na região de interesse, digitar o nome da imagem e definir o limiar estimado. Então execute o código.
Inspecione a imagem resultante e o número contado de partículas na imagem. Nesta análise representativa, micrografos fotográficos de células endoteliais cultivadas semeadas em um modelo de artéria carótida 3d podem ser observados por imagens microscópicas de campo brilhante e fluorescência. As contas de vidro fluorescentes de 10 mícrons de diâmetro, semeadas no modelo 3d, apresentaram um padrão de recirculação, sugerindo uma imitação bem sucedida de condições fisiológicas dentro do modelo.
A imagem do depoimento de partículas revelou que um maior nível de adesão das partículas às células foi observado fora da área de recirculação onde o estresse da tesoura da parede era alto. Seguindo este protocolo, partículas funcionalizadas com cinética de ligação específica e uma cultura central de células dentro de diferentes modelos de artéria humana podem ser exploradas para melhorar o modelo e estudar formulações específicas. Esta técnica fornece uma nova plataforma para estudar o direcionamento vascular dos portadores de drogas.
Recentemente, usamos para mostrar como a adutividade das partículas pode ser adaptada para atingir diferentes regiões de vasos doentes.
