본 의정서는 인체 혈관 시스템 내의 질병 부위를 표적으로 하는 약물 운반선의 연구 및 개발을 위한 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다. 우리의 기술의 주요 장점은 인간이 복제 한 3d 동맥 모델 내부에 약물 운반대의 축적을 연구 할 수 있다는 것입니다. 이것은 생리적인 조건 하에서 행해지며, 혈류를 포함하입니다.
이 접근법은 죽상 경화성 동맥을 포함하여 광범위한 혈관 질환의 진단 및 치료를 위한 약물 운반대를 최적화하는 데 사용할 수 있습니다. 환자또는 이전에 연구된 인간 경동맥 의 형상을 선택하고 이미지를 사용하여 금형의 컴퓨터 지원 설계 모델을 만드는 것으로 시작합니다. 3D 프린터를 사용하여 설계를 인쇄하고, 임시 인쇄 지지대를 제거하고, 사포를 사용하여 금형, 특히 지지대가 절단된 영역을 연마하고 매끄럽게 하기 전에 아세톤으로 모델을 헹구십시오.
샌드링 후 이소프로필 알코올로 모델을 헹구어 플라스틱 먼지를 제거하고 모델이 화학 후드에서 2~3시간 동안 건조할 수 있도록 합니다. 플라스틱의 환멸을 용이하게하기 위해 투명 옻칠로 모델을 세 번 스프레이하여 옻칠이 응용 프로그램 간에 1 시간 동안 공기 건조할 수 있도록합니다. 마지막 적용 후 페인트 브러시와 래커를 사용하여 프레임의 각 측면에 투명하고 직사각형 플라스틱 스트립을 붙이면 모델이 맨 아래에 밀봉되어 맨 위에 열립니다.
건조 후, 건조기에 금형을 배치하고 천천히 가난한 갓 준비 실리콘 고무 용액을 개구부에 넣습니다. 혼합물이 명확해질 때까지 기포를 제거하고 밤새 건조기 내부에 금형을 둡니다. 혼합물이 완전히 건조되면 투명 슬라이드를 제거하고 플라스틱이 완전히 용해 될 때까지 화학 후드에 48 시간 동안 절대 아세톤에 모델을 담그십시오.
세포 파종 전에 갇힌 아세톤을 증발시키기 위해 모델을 섭씨 60도에서 최소 4일 동안 배양합니다. 세포를 사용하여 모델을 시드하려면 먼저 자외선 또는 방사선에 의해 모델과 2개의 입구 및 콘센트 커넥터를 살균합니다. 20 분 후, 주사기를 사용하여 37섭씨에서 2 시간 동안 밀리리터 섬유 네틴 당 100 마이크로 그램의 4 밀리리터로 모델을 코팅합니다.
인큐베이션의 끝에서, 출구를 통해 섬유네틴 용액을 제거하고 내피 세포 배지로 모델을 세척한다. 주사기를 사용하여 내피 세포 중간 세포 현탁액의 밀리리터 당 2.5 배 10 ~ 6 번째 내피 세포의 4 밀리리터로 헹구는 모델을 채우고 세포 배양 인큐베이터 내부의 회전자에 모델을 고정하여 분당 1 회전에서 48 시간 동안 세포의 균질성 분포를 보장하십시오. 인큐베이션이 끝나면 10밀리리터 플라스틱 주사기를 사용하여 PBS로 모델을 세척합니다.
4%의 파라포름알데히드의 4밀리리터로 15분 동안 세포를 고정한 다음, 모델을 4밀리리터의 신선한 PBS로 섭씨 4도에서 저장하기 전에 시연된 대로 PBS로 모델을 세 번 세척합니다. 실험을 시작하기 전에 콘센트 튜빙을 사용하여 연막 펌프에 연결된 진동 댐퍼를 배양 된 경동맥 모델의 입구에 연결하고 튜브 조각을 사용하여 두 개의 콘센트를 병합하십시오. 그런 다음 콘센트 튜브를 두 개의 콘센트 튜브로 분할하고 각 튜브에 플라스틱 클램프를 추가합니다.
폐쇄 회로 구성을 설정하려면 300밀리리터의 PBS를 폐쇄 회로 용기에 추가하고 B와 C 클램프가 열리는 PBS 채워진 컨테이너 내부에 1개의 입구와 콘센트 튜브를 놓은 다음 다른 입구 튜브를 증류수로 채워진 1리터 세척 용기에 넣고 다른 콘센트 튜브를 빈 1리터 세척 용기에 넣고 D클램프가 있는 빈 1리터 폐기물에 넣습니다. 각각. 경동맥 모델을 스테레오 현미경 아래에 놓고 펌프를 분당 10회전의 시작 유량으로 설정하고 분당 5개의 회전증가가 4~5분마다 증가합니다. 유량이 분당 100회 회전에 도달하면 PBS밀리리터당 1.6마이크로그램의 형광 카박스형 폴리스티렌 입자를 폐쇄 회로 용기에 추가하고 10초마다 10초마다 관심 영역을 이미지화합니다.
개방형 회로 구성을 설정하려면 A 및 D 클램프를 열고 B 및 C 클램프를 즉시 닫습니다. 대부분의 물이 세척 용기에서 분당 100 회전에서 폐기물 용기로 흘러 들어오게하십시오. 물이 완전히 전달되기 전에 펌프를 멈추고 입구 앞과 경동맥 모델의 출구 후에 튜브 클램프를 닫습니다.
적절한 필터를 사용하여 관심 영역에서 모델의 이미지를 캡처하여 파티클의 증착 및 접착력을 셀에 표시합니다. 실험이 완료되면 사용자 지정된 소프트웨어 코드를 사용하여 관심 영역에서 캡처한 이미지를 분석하고 이미지 이름을 입력하고 예상 임계값을 설정합니다. 그런 다음 코드를 실행합니다.
결과 이미지와 이미지의 계산된 파티클 수를 검사합니다. 본 대표적인 분석에서, 3d 경동맥 모델에서 시드된 배양된 내피 세포의 사진 현미경 사진은 밝은 분야 및 형광 공초점 현미경 이미징에 의해 관찰될 수 있다. 3d 모델로 시드된 형광 10 미크론 직경 유리 구슬은 재순환 패턴을 나타내며 모델 내의 생리적 상태를 성공적으로 모방하는 것을 암시한다.
입자 증착의 화상 진찰은 벽 전단 응력이 높은 재순환 영역 외부에서 세포에 입자의 접착수준이 높은 것으로 나타났다. 이러한 프로토콜에 따라, 특정 결합 운동및 상이한 인간 동맥 모델 내의 세포의 핵심 배양을 가진 기능화된 입자는 모델을 개선하고 특정 제형을 연구하기 위해 탐구될 수 있다. 이 기술은 약 운반대의 혈관 표적을 공부하기 위한 새로운 플랫폼을 제공합니다.
우리는 최근에 입자의 첨가도 다른 질병 혈관 영역을 대상으로 조정할 수있는 방법을 보여주기 위해 그것을 사용했다.
