Das vorliegende Protokoll könnte als neue Plattform für die Untersuchung und Entwicklung von Arzneimittelträgern dienen, um Krankheitsstellen innerhalb des menschlichen Gefäßsystems anzusprechen. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung der Akkumulation von Arzneimittelträgern innerhalb des vom Menschen replizierten arteriellen 3D-Modells ermöglicht. Dies geschieht unter physiologischen Bedingungen, einschließlich des Blutflusses.
Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Arzneimittelträger für die Diagnose und Behandlung einer Vielzahl von Gefäßerkrankungen, einschließlich einer atherosklerotischen Arterie, zu optimieren. Beginnen Sie mit der Auswahl von Bildern von Patienten oder zuvor untersuchten Geometrien der Verzweigung der menschlichen Halsschlagader und verwenden Sie die Bilder, um ein computergestütztes Designmodell der Form zu erstellen. Verwenden Sie einen 3D-Drucker, um das Design zu drucken, entfernen Sie die temporären Druckstützen und spülen Sie das Modell mit Aceton, bevor Sie Schleifpapier verwenden, um die Formen zu polieren und zu glätten, insbesondere die Bereiche, aus denen die Stützen geschnitten wurden.
Spülen Sie das Modell nach dem Schleifen mit Isopropylalkohol ab, um Plastikstaub zu entfernen, und lassen Sie das Modell zwei bis drei Stunden in einer chemischen Haube trocknen. Um eine einfache Desillusionierung des Kunststoffs zu erleichtern, besprühen Sie das Modell dreimal mit transparentem Lack, so dass der Lack zwischen den Anwendungen eine Stunde lang an der Luft trocknen kann. Verwenden Sie nach der letzten Anwendung einen Pinsel und lack, um transparente, rechteckige Streifen aus glattem Kunststoff auf jede Seite des Rahmens zu kleben, so dass das Modell unten versiegelt und oben geöffnet wird.
Nach dem Trocknen die Form in einen Trockenmittel geben und langsam schlecht frisch zubereitete Silikonkautschuklösung in die Öffnung geben. Entfernen Sie die Luftblasen, bis die Mischung klar ist, und lassen Sie die Form über Nacht im Austrocknungsmittel. Wenn die Mischung vollständig trocken ist, entfernen Sie die transparenten Dias und tauchen Sie das Modell 48 Stunden lang in absoluten Aceton in eine chemische Haube, bis der Kunststoff vollständig gelöst ist.
Um das eingeschlossene Aceton vor der Zellaussaat zu verdampfen, inkubieren Sie das Modell mindestens vier Tage lang bei 60 Grad Celsius. Um das Modell mit Zellen zu säen, sterilisieren Sie zuerst das Modell und zwei Ein- und Auslassanschlüsse durch ultraviolettes Licht oder Strahlung. Nach 20 Minuten wird das Modell mit einer Spritze mit vier Millilitern 100 Mikrogramm pro Milliliter Fibronektin für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius beschichtet.
Am Ende der Inkubation die Fibronektinlösung durch den Auslass entfernen und das Modell mit Endothelzellmedium waschen. Verwenden Sie eine Spritze, um das gespülte Modell mit vier Millilitern einer 2,5 mal 10 bis sechsten Endothelzellen pro Milliliter Endothelzellmediumzellsuspension zu füllen und das Modell 48 Stunden bei einer Umdrehung pro Minute an einem Rotator in einem Zellkulturinkubator zu befestigen, um eine homogene Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine 10-Milliliter-Kunststoffspritze, um das Modell mit PBS zu waschen.
Fixieren Sie die Zellen für 15 Minuten mit vier Millilitern 4% Paraformaldehyd und waschen Sie das Modell dann dreimal mit PBS, wie gezeigt, bevor Sie das Modell bei vier Grad Celsius in vier Millilitern frischem PBS lagern. Bevor Sie mit einem Experiment beginnen, verwenden Sie den Auslassschlauch, um einen Schwingungsdämpfer, der mit einer Peristaltikpumpe verbunden ist, mit dem Einlass des kultivierten Carotismodells zu verbinden, und verwenden Sie ein Stück Schlauch, um die beiden Auslässe zu verschmelzen. Dann teilen Sie den Auslassschlauch in zwei Auslassrohre auf und fügen Sie jedem Rohr eine Kunststoffklemme hinzu.
Um eine geschlossene Kreislaufkonfiguration einzurichten, fügen Sie 300 Milliliter PBS in einen geschlossenen Kreislaufbehälter hinzu und legen Sie einen Einlass und ein Auslassrohr in den PBS-gefüllten Behälter mit geöffneten B- bzw. C-Klemmen, legen Sie dann das andere Einlassrohr in einen ein Liter-Waschbehälter, der mit destilliertem Wasser gefüllt ist, und das andere Auslassrohr in einen leeren Ein-Liter-Abfallbehälter mit geschlossenen A- und D-Klemmen. beziehungsweise. Stellen Sie das Carotismodell unter ein Stereomikroskop, stellen Sie die Pumpe auf eine Startdurchflussrate von 10 Umdrehungen pro Minute ein, wobei alle vier bis fünf Minuten ein Anstieg um die Umdrehung pro Minute zunimmt. Wenn die Durchflussrate 100 Umdrehungen pro Minute erreicht, fügen Sie 1,6 Mikrogramm fluoreszierende carboxylierte Polystyrolpartikel pro Milliliter PBS in den geschlossenen Kreislaufbehälter hinzu und stellen Sie den interessierenden Bereich alle 10 Sekunden für eineinhalb Stunden ab.
Um eine Konfiguration mit offenem Stromkreis einzurichten, öffnen Sie die A- und D-Klemmen und schließen Sie sofort die B- und C-Klemmen. Lassen Sie den größten Teil des Wassers mit 100 Umdrehungen pro Minute vom Waschbehälter zum Abfallbehälter fließen. Bevor das Wasser vollständig übertragen wurde, stoppen Sie die Pumpe und schließen Sie die Rohrklemmen vor dem Einlass und nach dem Auslass des Halsschlagadermodells.
Erfassen Sie mit den entsprechenden Filtern Bilder des Modells im interessierende Bereich, um die Ablagerung und Haftung der Partikel an den Zellen zu zeigen. Verwenden Sie nach Abschluss des Experiments einen benutzerdefinierten Softwarecode, um die in der interessierenden Region aufgenommenen Bilder zu analysieren, geben Sie den Namen des Bildes ein und legen Sie den geschätzten Schwellenwert fest. Führen Sie dann den Code aus.
Überprüfen Sie das resultierende Bild und die gezählte Anzahl von Partikeln im Bild. In dieser repräsentativen Analyse können Photomikroskopien von kultivierten Endothelzellen, die in einem 3D-Carotis-Arterienmodell ausgesät sind, durch konfokale mikroskopische Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung beobachtet werden. Fluoreszierende Glasperlen mit einem Durchmesser von 10 Mikron, die in das 3D-Modell eingesät wurden, zeigten ein Rezirkulationsmuster, was auf eine erfolgreiche Nachahmung physiologischer Bedingungen innerhalb des Modells hindeutet.
Die Abbildung der Partikelablagerung ergab, dass eine höhere Adhäsion der Partikel an den Zellen außerhalb des Rezirkulationsbereichs beobachtet wurde, in dem die Wandscherspannung hoch war. Nach diesem Protokoll können funktionalisierte Partikel mit spezifischer Bindungskinetik und einer Kernkultur von Zellen innerhalb verschiedener menschlicher Arterienmodelle untersucht werden, um das Modell zu verbessern und spezifische Formulierungen zu untersuchen. Diese Technik bietet eine neue Plattform für die Untersuchung des vaskulären Targetings von Arzneimittelträgern.
Wir haben damit kürzlich gezeigt, wie die Additivität von Partikeln auf verschiedene erkrankte Gefäßregionen zugeschnitten werden kann.
