El actual protocolo puede servir como nueva plataforma para el estudio y el desarrollo de los portadores de la droga para apuntar sitios de la enfermedad dentro del sistema vascular humano. La principal ventaja de nuestra técnica es que permite el estudio de la acumulación de portadores de fármacos dentro del modelo arterial 3D replicado por humanos. Esto se hace bajo condiciones fisiológicas, incluyendo el flujo sanguíneo.
Este acercamiento se puede utilizar para optimizar los portadores de la droga para la diagnosis y el tratamiento de una amplia gama de enfermedades vasculares, incluyendo arterias ateroscleróticas. Comience seleccionando imágenes de pacientes o geometrías previamente estudiadas de la bifurcación de la arteria carótida humana y utilizando las imágenes para crear un modelo de diseño asistido por computadora del molde. Utilice una impresora 3D para imprimir el diseño, retire los soportes de impresión temporales y enjuague el modelo con acetona antes de usar papel de lija para pulir y alisar los moldes, especialmente las áreas de las que se cortaron los soportes.
Después del lijado, enjuague el modelo con alcohol isopropílico para eliminar cualquier polvo plástico y permitir que el modelo se seque en una campana química durante dos o tres horas. Para facilitar la fácil desilusión del plástico, rocíe el modelo con laca transparente tres veces, permitiendo que la laca se seque al aire durante una hora entre aplicaciones. Después de la última aplicación, use un pincel y una laca para pegar tiras transparentes y rectangulares de plástico liso a cada lado del marco, de modo que el modelo se sellará en la parte inferior y se abrirá en la parte superior.
Después del secado, coloque el molde en un desecador y lentamente pobre solución de caucho de silicona recién preparada en la abertura. Retire las burbujas de aire hasta que la mezcla esté clara y deje el molde dentro del desecador durante la noche. Cuando la mezcla esté completamente seca, retire los portaobjetos transparentes y sumerja el modelo en acetona absoluta durante 48 horas en una campana química hasta que el plástico esté completamente disuelto.
Para evaporar la acetona atrapada antes de la siembra celular, incube el modelo durante al menos cuatro días a 60 grados Centígrados. Para sembrar el modelo con células, primero esterilice el modelo y dos conectores de entrada y salida por luz ultravioleta o radiación. Después de 20 minutos, usando una jeringa para recubrir el modelo con cuatro mililitros de 100 microgramos por mililitro de fibronectina durante dos horas a 37 grados Centígrados.
Al final de la incubación, retire la solución de fibronectina a través de la salida y lave el modelo con medio celular endotelial. Utilice una jeringa para llenar el modelo enjuagado con cuatro mililitros de un 2,5 veces 10 a las sextas células endoteliales por mililitro de suspensión de células medianas de células endoteliales y asegure el modelo a un rotador dentro de una incubadora de cultivo celular 48 horas a una revolución por minuto, para asegurar la distribución homogénea de las células. Al final de la incubación, use una jeringa de plástico de 10 mililitros para lavar el modelo con PBS.
Fije las células durante 15 minutos, con cuatro mililitros de paraformadehído al 4%, luego lave el modelo tres veces con PBS como se ha demostrado antes de almacenar el modelo a cuatro grados Celsius en cuatro mililitros de PBS fresco. Antes de comenzar un experimento, utilice el tubo de salida para conectar un amortiguador de oscilación conectado a una bomba peristáltica a la entrada del modelo carotídeo cultivado y utilice una pieza de tubo para fusionar las dos salidas. Luego divida el tubo de salida en dos tubos de salida y agregue una abrazadera de plástico a cada tubo.
Para establecer una configuración de circuito cerrado, agregue 300 mililitros de PBS a un contenedor de circuito cerrado y coloque un tubo de entrada y un tubo de salida dentro del contenedor lleno de PBS con las abrazaderas B y C abiertas, respectivamente, luego coloque el otro tubo de entrada en un contenedor de lavado de un litro lleno de agua destilada, y el otro tubo de salida en un contenedor de residuos vacío de un litro con las abrazaderas A y D cerradas, respectivamente. Coloque el modelo carotídeo bajo un microscopio estéreo, establezca la bomba a una tasa de flujo inicial de 10 revoluciones por minuto, con aumentos de cinco revoluciones por minuto cada cuatro a cinco minutos. Cuando el caudal alcance las 100 revoluciones por minuto, añada 1,6 microgramos de partículas fluorescentes de poliestireno carboxilado por mililitro de PBS al contenedor de circuito cerrado e imagen de la región de interés cada 10 segundos durante una hora y media.
Para configurar una configuración de circuito abierto, abra las abrazaderas A y D y cierre inmediatamente las abrazaderas B y C. Deje que la mayor parte del agua fluya desde el contenedor de lavado hasta el contenedor de residuos a 100 revoluciones por minuto. Antes de que el agua se haya transferido por completo, detenga la bomba y cierre las abrazaderas del tubo antes de la entrada y después de la salida del modelo carotídeo.
Utilizando los filtros apropiados, capture imágenes del modelo en la región de interés para mostrar la deposición y adhesión de las partículas a las celdas. Al finalizar el experimento, utilice un código de software personalizado para analizar las imágenes capturadas en la región de interés, introduzca el nombre de la imagen y establezca el umbral estimado. A continuación, ejecute el código.
Inspeccione la imagen resultante y el número contado de partículas en la imagen. En este análisis representativo, las micrografías de la foto de las células endoteliales cultivadas sembradas en un modelo 3d de la arteria carótida se pueden observar por proyección de imagen microscópica confocal del brightfield y de la fluorescencia. Fluorescentes 10 micrones diámetro de cuentas de vidrio, sembrado en el modelo 3D exhibió un patrón de recirculación, lo que sugiere una imitación exitosa de las condiciones fisiológicas dentro del modelo.
La proyección de imagen de la deposición de la partícula reveló que un de mayor nivel de adherencia de las partículas a las células fue observado fuera del área de la recirculación donde estaba alta la tensión de cizalladura de la pared. Siguiendo este protocolo, las partículas funcionalizadas con cinética de unión específica y un cultivo central de células dentro de diferentes modelos de arterias humanas pueden explorarse para mejorar el modelo y estudiar formulaciones específicas. Esta técnica proporciona una nueva plataforma para estudiar la blanco vascular de los portadores de la droga.
Recientemente lo hemos utilizado para mostrar cómo la agregividad de las partículas se puede adaptar para dirigirse a diferentes regiones de vasos enfermos.
