Mevcut protokol, insan damar sistemi içindeki hastalık bölgelerini hedeflemek için ilaç taşıyıcılarının çalışması ve geliştirilmesi için yeni bir platform görevi görebilebilir. Tekniğimizin en büyük avantajı, ilaç taşıyıcılarının insan tarafından çoğaltılan 3d arteriyel model içinde birikmesinin incelenmesine izin veriyor olmasıdır. Bu, kan akışı da dahil olmak üzere fizyolojik koşullar altında yapılır.
Bu yaklaşım, aterosklerotik arterler de dahil olmak üzere çok çeşitli vasküler hastalıkların tanı ve tedavisi için ilaç taşıyıcılarını optimize etmek için kullanılabilir. Hastalardan veya daha önce çalışılan insan şahdamar çatallanmasının geometrilerini seçerek ve kalıpların bilgisayar destekli bir tasarım modelini oluşturmak için görüntüleri kullanarak başlayın. Tasarımı yazdırmak, geçici baskı desteklerini kaldırmak ve kalıpları, özellikle desteklerin kesildiği alanları parlatmak ve pürüzsüz hale getirmek için zımpara kağıdı kullanmadan önce modeli asetonla durulamak için 3d yazıcı kullanın.
Zımparalamadan sonra, herhangi bir plastik tozu çıkarmak ve modelin kimyasal bir başlıkta iki ila üç saat kurumasını sağlamak için modeli izopropil alkolle durulayın. Plastiğin kolayca hayal kırıklığına uğramış olmasını kolaylaştırmak için, modeli şeffaf vernikle üç kez püskürtün ve verniklerin uygulamalar arasında bir saat boyunca havayla kurumasını bekleyin. Son uygulamadan sonra, şeffaf, dikdörtgen pürüzsüz plastik şeritleri çerçevenin her iki tarafına yapıştırmak için bir boya fırçası ve cila kullanın, böylece model altta kapatılır ve üstte açılır.
Kuruduktan sonra, kalıbı bir kurutucuya yerleştirin ve yavaşça zayıf taze hazırlanmış silikon kauçuk çözeltisini açıklığa yerleştirin. Karışım temizlenine kadar hava kabarcıklarını çıkarın ve kalıbı bir gecede kurutucunun içinde bırakın. Karışım tamamen kuru olduğunda, şeffaf slaytları çıkarın ve plastik tamamen çözünene kadar modeli kimyasal bir kaputta 48 saat boyunca mutlak aseton içine daldırin.
Hücre tohumlamadan önce sıkışmış asetonları buharlaşmak için modeli 60 santigrat derecede en az dört gün kuluçkaya yatırın. Modeli hücrelerle tohumlamak için, önce modeli ve iki giriş ve çıkış konektörünü ultraviyole ışık veya radyasyonla sterilize edin. 20 dakika sonra, modeli 37 santigrat derecede iki saat boyunca mililitre fibronektin başına dört mililitre 100 mikrogramla kaplamak için bir şırınga kullanarak.
Kuluçkanın sonunda, fibronektin çözeltisini çıkıştan çıkarın ve modeli endotel hücre ortamı ile yıkayın. Durulanmış modeli, endotel hücreli orta hücre süspansiyonunun mililitresi başına 2,5 çarpı 10'un dört mililitresi ile doldurmak ve hücrelerin homojen dağılımını sağlamak için modeli dakikada bir devirde 48 saat hücre kültürü inkübatörü içindeki bir rotatöre sabitlemek için bir şırınna kullanın. Kuluçkanın sonunda, modeli PBS ile yıkamak için 10 mililitrelik plastik bir şırınna kullanın.
Hücreleri 15 dakika boyunca dört mililitre %4 paraformaldehit ile sabitleyin, ardından modeli dört mililitre taze PBS'de dört santigrat derecede saklamadan önce gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın. Bir deneye başlamadan önce, peristaltik bir pompaya bağlı bir salınım damperini kültürlü karotid modelinin girişine bağlamak için çıkış borularını kullanın ve iki çıkışı birleştirmek için bir boru parçası kullanın. Daha sonra çıkış borularını iki çıkış tüpüne bölün ve her tüpe plastik bir kelepçe ekleyin.
Kapalı devre konfigürasyonu kurmak için, kapalı devre bir kaba 300 mililitre PBS ekleyin ve sırasıyla B ve C kelepçeleri açık olan PBS dolu kabın içine bir giriş ve bir çıkış tüpü yerleştirin, ardından diğer giriş tüpünü damıtılmış suyla dolu bir litrelik bir yıkama kabına ve diğer çıkış tüpünü A ve D kelepçeleri kapalı boş bir tek litrelik atık kabına yerleştirin, sırasıyla. Karotis modelini stereo mikroskop altına yerleştirin, pompayı dakikada 10 devirlik bir başlangıç akış hızına ayarlayın ve dakikada beş devir artış her dört ila beş dakikada bir artar. Akış hızı dakikada 100 devire ulaştığında, kapalı devre kabına PBS mililitresi başına 1,6 mikrogram floresan karboksilatlı polistiren parçacık ekleyin ve ilgi çekici bölgeyi bir buçuk saat boyunca her 10 saniyede bir görüntüleyin.
Açık devre konfigürasyonu kurmak için A ve D kelepçelerini açın ve B ve C kelepçelerini hemen kapatın. Suyun büyük bir kısmının dakikada 100 devirde yıkama kabından atık konteynerine akmasına izin verin. Su tamamen aktarılmadan önce, pompayı durdurun ve karotid modelinin girişinden önce ve çıktıktan sonra tüp kelepçelerini kapatın.
Uygun filtreleri kullanarak, parçacıkların hücrelere birikmesini ve yapışmasını göstermek için modelin ilgi çekici bölgedeki görüntülerini yakalayın. Deneme tamamlandıktan sonra, ilgi çekici bölgede yakalanan görüntüleri analiz etmek için özelleştirilmiş bir yazılım kodu kullanın, görüntünün adını girin ve tahmini eşiği ayarlayın. O zaman kodu çalıştır.
Elde edilen görüntüyü ve görüntüdeki sayılan parçacık sayısını inceleyin. Bu temsili analizde, 3d karotis arter modelinde tohumlanan kültürlü endotel hücrelerinin fotoğraf mikrografileri brightfield ve floresan konfokal mikroskobik görüntüleme ile gözlemlenebilir. Floresan 10 mikron çapında cam boncuk, 3d modele tohumlanmış bir devridaim deseni sergiledi ve modeldeki fizyolojik koşulların başarılı bir şekilde taklit edildiğini düşündürmektedir.
Parçacık birikiminin görüntülenmesi, duvar kesme stresinin yüksek olduğu devridaim alanının dışında parçacıkların hücrelere daha yüksek düzeyde yapışıklığının gözlendiğini ortaya koydu. Bu protokolün ardından, modeli geliştirmek ve belirli formülasyonları incelemek için spesifik bağlayıcı kinetiklere ve farklı insan arter modellerindeki hücrelerin çekirdek kültürüne sahip fonksiyonelleştirilmiş parçacıklar araştırılabilir. Bu teknik, ilaç taşıyıcılarının damar hedeflemesini incelemek için yeni bir platform sağlar.
Son zamanlarda parçacıkların additivity farklı hastalıklı damar bölgelerini hedeflemek için nasıl uyarlanabileceğini göstermek için kullandık.
