טחב אבקתי הוא מחלה צמחית חשובה. קביעה מדויקת של פנוטיפ המחלה דורשת אפילו חיסון של הפתוגן. מכיוון שהשיטות הקיימות אינן יעילות, פיתחנו פרוטוקול זה.
שיטת חיסון הנבגים שלנו יכולה להשיג בקלות אפילו חיסון, והיא פשוטה וניתנת להרחבה. לפיכך, כל מעבדה העובדת עם טחב אבקתי יכולה בקלות להשתמש בשיטה זו. החוקרים יכולים גם להרכיב רשת על קופסת קרטון ולהשתמש בה לחיסון נבגים.
כיצד לנתק נבגים ולצחצח אותם דרך רשת הוא צעד קריטי. אז להדגים את זה בווידאו יכול להיות מאוד מועיל. עבור פרוטוקול זה, קבל גליל של רשת קרום ניילון 50 מיקרומטר או רשת נירוסטה של 48 מיקרומטר.
חותכים דיקט גדול בגודל בינוני לחתיכות של 24.5X10 אינץ' ו-12X10 אינץ' להכנת קופסת חיסון. כדי ליצור מכסה עליון נשלף עם רשת, חתכו את הדיבל המרובע הארוך מעץ לשני סטים של 26 אינץ' ו-12.75 אינץ'. הדביקו ומסמרו את ארבעת החלקים כך שיתאימו מסביב לקופסה.
קחו יריעות אקריליק והרכיבו את כל יריעות האקריליק לקופסה, באמצעות שמונה מלחציים פינתיים. חותכים חלון פתיחה בגודל 7X2 אינץ 'בצד הקדמי של יריעת האקריליק של הקופסה. כדי להכין נבגי טחב אבקתיים טריים כאינוקולה, לגדל צמחים מוטנטיים נקיים של אראבידופסיס עם פגיעה במערכת החיסון4-1 בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 65% במשך שישה עד שמונה שבועות.
לגדל את הצמחים כדי לקבוע פנוטיפים זיהום בדירות סטנדרטיות. יש לחסן אחד או מחצית מצמחי הפד4-1 כדי לבנות מספיק נבגי טחב אבקתיים טריים. כאשר נבגים טריים מצמחים נגועים זמינים, העבירו דירה של צמחים לתוך תיבת החיסון בתוך תא החיסון לבדיקת זיהום.
חותכים 15 עד 20 עלי ערבידופסיס נגועים בכבדות, ומניחים להם להתייבש אם יש מים מעובים. החזיקו אחד או שניים עלים הפוכים ביד אחת עם זוג מלקחיים ארוכים. לאחר מכן הכניסו את שתי הידיים דרך פתח החדר ופגעו בעדינות בזרוע המלקחיים עם זוג מספריים, תוך כדי הזזה איטית של העלים מעל הרשת המותקנת על תיבת החיסון.
הברישו את הנבגים עם מברשות בלנדר מאוורר עדינות דרך כל משטח הרשת בכיוונים שונים כדי למקסם את הפיזור השווה של הנבגים על הצמחים. טפחו בעדינות על הרשת כמה פעמים עם המברשות כדי לנער את הנבגים שנתקעו ברשת. לאחר שהנבגים שוקעים, הוציאו את הדירה המכילה את הצמחים המחוסנים מקופסת החיסונים.
מכסים את הדירה בכיפת פלסטיק ומניחים אותה בתא גידול בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-65% לחות יחסית. פנוטיפ המחלה יכול להתבצע ב 5 או 8 עד 12 ימים לאחר החיסון. המירו קופסאות קרטון לקופסת חיסון על ידי הסרת הצדדים העליונים והתחתונים של הקופסה, הדבקת הפינה כדי למצק אותה והרכבת רשת של 50 מיקרומטר בחלק העליון עם דבק.
הזיזו את השטוח המכיל את הצמחים בתוך תא החיסונים, והניחו את קופסת החיסונים הקטנה יותר על גבי הדירה כדי לכסות את הצמחים. לאחר מכן לנתק ולצחצח את הנבגים. הכינו קופסת חיסונים קטנה וקצת יותר גדולה מצלחת פטרי.
אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במקרר עד לשימוש. חותכים עלה אחד או שניים מורחבים במלואם מבסיס הפטיולה כדי שכל צמח ייבדק. מכניסים את הפטיולה של העלים המנותקים למדיום האגר בזווית של 30 מעלות.
לחסן את העלים בתוך תא החיסון, ולהעביר את הצלחת עם המכסה לתא הצמיחה. להערכת פנוטיפים של זיהום, מעבירים את העלים לצלחת אגר MS אספטית טרייה ארבעה או חמישה ימים לאחר החיסון. חותכים את בסיס הפטיולה לפני הכנסת העלים למדיום האגר הטרי.
להעריך את פנוטיפים המחלה בשמונה או תשעה ימים לאחר החיסון. הניתוח המיקרוסקופי הציג פיזור שווה של נבגים על השקופיות המיקרוסקופיות בתחתית הדירה. צפיפות הנבגים המחושבת, שהתפזרו בשישה מקומות שונים לאחר חיסוני האור, לא הראתה הבדלים משמעותיים.
תוצאות דומות הושגו לאחר חיסונים כבדים בנבגים. אחידות החיסון נבדקה בין גנוטיפים שונים של צמחים ב-12 יום לאחר חיסון כבד. צמחי הפד4-1 הראו רגישות מוגברת למחלות בהשוואה לקולומביה 0, צמחי הבר.
שימוש בנבגים טריים בכמות מספקת, המיוצרים כ-10 ימים לאחר החיסון, על צמחים רגישים, הם חשובים, משום שנבגים טריים קלים יותר לעקירה, וסביר יותר שהם יבססו התיישבות. טחב אבקתי מאכלס רק תאי אפידרמיס צמחיים. בידוד של תאים נגועים בטחב אבקתי על ידי קילוף האפידרמיס, או מיקרו-דיסקציה בלייזר, יאפשר מחקר תעתיק ופרוטאומי ממוקד יותר של תגובות המארח.
שיטה זו תסייע לחוקרים לקבוע ביעילות רבה יותר פנוטיפים של זיהום טחב אבקתי, ולכן אמורה לאפשר מחקרים פונקציונליים יעילים יותר על אינטראקציות טחב אבקתי צמחי.
