Мучнистая роса является важным заболеванием растений. Точное определение фенотипа заболевания требует равномерной прививки возбудителя. Поскольку существующие методы неэффективны, мы разработали этот протокол.
Наш метод курсовой инокуляции может легко достичь даже инокуляции, и он прост и масштабируем. Следовательно, любая лаборатория, работающая с мучнистой росой, может легко использовать этот метод. Исследователи также могут установить сетку на картонную коробку и использовать ее для курсовой инокуляции.
Как выбить споры и расчесать их через сетку , является критическим шагом. Поэтому демонстрация этого на видео может быть очень полезной. Для этого протокола получите рулон из 50-микрометровой нейлоновой мембранной сетки или 48-микрометровой сетки из нержавеющей стали.
Нарежьте фанеру большого размера средней плотности на куски размером 24,5X10 дюймов и 12X10 дюймов для изготовления коробки для прививок. Чтобы сделать съемную верхнюю крышку с сеткой, разрежьте длинный деревянный квадратный дюбель на два комплекта по 26 дюймов и 12,75 дюйма. Приклейте и прибейте четыре части, чтобы они облегали коробку.
Возьмите акриловые листы и соберите все акриловые листы в коробку, используя восемь угловых зажимов. Вырежьте открывающееся окно размером 7X2 дюйма на лицевой стороне акрилового листа коробки. Чтобы приготовить свежие споры мучнистой росы в виде инокулы, выращивайте чистые мутантные растения Arabidopsis с ослабленным иммунитетом pad4-1 в камере роста при 22 градусах Цельсия и относительной влажности 65% в течение шести-восьми недель.
Выращивайте растения для определения фенотипов инфекции в стандартных квартирах. Инокулируйте одну или половину растений pad4-1, чтобы построить достаточное количество свежих спор мучнистой росы. Когда свежие споры из зараженных растений доступны, переместите плоскую часть растений в ящик для вакцинации внутри камеры инокуляции для теста на инфекцию.
Срежьте от 15 до 20 сильно зараженных листьев арабидопсиса и дайте им высохнуть, если есть конденсированная вода. Подержите одну-две капли вверх ногами в одной руке парой длинных щипцов. Затем проведите обеими руками через отверстие камеры и осторожно ударьте ножницами по руке щипцов, медленно перемещая листья над сеткой, установленной на ящике для прививки.
Смажьте споры тонкими щетками блендера с вентилятором по всей поверхности сетки в разных направлениях, чтобы максимизировать равномерное распределение спор на растениях. Осторожно похлопайте сетку несколько раз щетками, чтобы стряхнуть споры, застрявшие в сетке. Как только споры осядут, переместите квартиру, содержащую привитые растения, из ящика для вакцинации.
Накройте квартиру пластиковым куполом и поместите ее в камеру роста при температуре 22 градуса Цельсия и относительной влажности 65%. Фенотипирование заболевания может быть выполнено через 5 или 8-12 дней после прививки. Превратите картонные коробки в коробку для прививки, удалив верхнюю и нижнюю стороны коробки, заклеив угол, чтобы укрепить его, и установив 50-микрометровую сетку сверху с помощью клея.
Переместите квартиру, содержащую растения, внутрь камеры для вакцинации и поместите меньшую коробку для вакцинации поверх плоскости, чтобы покрыть растения. Затем выбить и смахнуть споры. Сделайте мини-прививочную коробку немного больше, чем чашка Петри.
Храните тарелки при четырех градусах Цельсия в холодильнике до использования. Срежьте один или два полностью расширенных листа с основания черешка для каждого растения, подлежащего тестированию. Вставьте черешок отсоединившихся листьев в агаровую среду под углом 30 градусов.
Инокулируйте листья внутри камеры инокуляции и переместите пластину с крышкой в камеру роста. Для оценки фенотипов инфекции перенесите листья на свежую асептическую агаровую пластину РС через четыре или пять дней после посева. Срежьте основание черешка перед тем, как вставить листья в среду свежего агара.
Оцените фенотипы заболевания через восемь или девять дней после прививки. Микроскопический анализ показал равномерное распределение спор на микроскопических слайдах на дне квартиры. Расчетная плотность спор, распределенных в шести различных местах после легких прививок, не показала существенных различий.
Аналогичные результаты были достигнуты после тяжелых прививок спорами. Равномерность прививки исследовали среди различных генотипов растений через 12 дней после тяжелой инокуляции. Растения pad4-1 показали повышенную восприимчивость к болезням по сравнению с Columbia 0, растениями дикого типа.
Использование адекватных свежих спор, полученных примерно через 10 дней после прививки, на восприимчивых растениях, важно, потому что свежие споры легче вытеснить и с большей вероятностью установят колонизацию. Мучнистая роса только колонизирует клетки эпидермиса растений. Выделение инфицированных мучнистой росой клеток путем очистки эпидермиса или лазерной микродиссекции позволит проводить более целенаправленное транскриптомное и протеомное исследование реакций хозяина.
Этот метод поможет исследователям более эффективно определять фенотипы инфекции мучнистой росы и, следовательно, должен способствовать более эффективным функциональным исследованиям взаимодействий растительной мучнистой росы.
