L'oidio è un'importante malattia delle piante. La determinazione accurata del fenotipo della malattia richiede anche l'inoculazione del patogeno. Poiché i metodi esistenti sono inefficienti, abbiamo sviluppato questo protocollo.
Il nostro metodo di inoculazione delle spore può facilmente raggiungere un'inoculazione uniforme ed è semplice e scalabile. Quindi, qualsiasi laboratorio che lavora con l'oidio può facilmente utilizzare questo metodo. I ricercatori possono anche montare la rete su una scatola di cartone e usarla per l'inoculazione delle spore.
Come rimuovere le spore e spazzolarle attraverso la rete è un passaggio critico. Quindi dimostrarlo in video potrebbe essere molto utile. Per questo protocollo, ottenere un rotolo di rete a membrana di nylon da 50 micrometri o da 48 micrometri in acciaio inossidabile.
Tagliare compensato di grandi dimensioni e media densità in pezzi di 24,5X10 pollici e 12X10 pollici per realizzare una scatola di inoculazione. Per realizzare un coperchio superiore rimovibile con una rete, tagliare il lungo tassello quadrato di legno in due set da 26 pollici e 12,75 pollici. Incollare e inchiodare i quattro pezzi per adattarli alla scatola.
Prendi i fogli acrilici e assembla tutti i fogli acrilici in una scatola, usando otto morsetti angolari. Tagliare una finestra di apertura da 7X2 pollici sul lato anteriore del foglio acrilico della scatola. Per preparare spore fresche di oidio come inocula, coltivare piante mutanti pad4-1 immuno-compromesse di Arabidopsis pulite in una camera di crescita a 22 gradi Celsius e 65% di umidità relativa per sei-otto settimane.
Coltiva le piante per determinare i fenotipi di infezione negli appartamenti standard. Inoculare una o metà delle piante pad4-1 per costruire sufficienti spore fresche di oidio. Quando sono disponibili spore fresche di piante infette, spostare un piatto di piante nella scatola di inoculazione all'interno della camera di inoculazione per un test di infezione.
Tagliare da 15 a 20 foglie di Arabidopsis fortemente infette e lasciarle asciugare se c'è acqua condensata. Tenere una o due foglie capovolte in una mano con un paio di lunghe pinze. Quindi mettere entrambe le mani attraverso l'apertura della camera e colpire delicatamente il braccio della pinza con un paio di forbici, mentre si muovono lentamente le foglie sopra la rete montata sulla scatola di inoculazione.
Spazzolare le spore con spazzole sottili del frullatore a ventaglio attraverso l'intera superficie della rete in direzioni diverse per massimizzare la distribuzione uniforme delle spore sulle piante. Picchiettare delicatamente la rete un paio di volte con i pennelli per scrollarsi di dosso le spore bloccate nella rete. Una volta che le spore si depositano, spostare fuori l'appartamento contenente le piante inoculate dalla scatola di inoculazione.
Coprire l'appartamento con una cupola di plastica e posizionarlo in una camera di crescita a 22 gradi Celsius e 65% di umidità relativa. La fenotipizzazione della malattia può essere eseguita a 5 o 8-12 giorni dopo l'inoculazione. Converti le scatole di cartone in una scatola di inoculazione rimuovendo i lati superiore e inferiore della scatola, nastrando l'angolo per rassodarlo e montando una rete di 50 micrometri sulla parte superiore con colla.
Spostare l'appartamento contenente le piante all'interno della camera di inoculazione e posizionare la scatola di inoculazione più piccola sopra l'appartamento per coprire le piante. Quindi rimuovere e spazzolare le spore. Crea una mini scatola di inoculazione leggermente più grande di una capsula di Petri.
Conservare i piatti a quattro gradi Celsius in frigorifero fino all'uso. Tagliare una o due foglie completamente espanse dalla base del picciolo per ogni pianta da testare. Inserire il picciolo delle foglie staccate nel mezzo agar con un angolo di 30 gradi.
Inoculare le foglie all'interno della camera di inoculazione e spostare la piastra con il coperchio in una camera di crescita. Per valutare i fenotipi dell'infezione, trasferire le foglie in una piastra di agar MS asettico fresco a quattro o cinque giorni dopo l'inoculazione. Tagliare la base del picciolo prima di inserire le foglie nel mezzo di agar fresco.
Valutare i fenotipi della malattia a otto o nove giorni dopo l'inoculazione. L'analisi microscopica ha mostrato una distribuzione uniforme delle spore sui vetrini microscopici sul fondo dell'appartamento. La densità calcolata delle spore, distribuite in sei diverse posizioni dopo inoculazioni leggere, non ha mostrato differenze significative.
Risultati simili sono stati raggiunti a seguito di pesanti inoculazioni con spore. L'uniformità dell'inoculazione è stata esaminata tra diversi genotipi vegetali a 12 giorni dopo l'inoculazione pesante. Le piante pad4-1 hanno mostrato una maggiore suscettibilità alla malattia rispetto alla Columbia 0, le piante selvatiche.
L'uso di spore fresche adeguate, prodotte circa 10 giorni dopo l'inoculazione, su piante sensibili, è importante, perché le spore fresche sono più facili da rimuovere e hanno maggiori probabilità di stabilire la colonizzazione. L'oidio colonizza solo le cellule epidermiche delle piante. L'isolamento delle cellule infette da oidio mediante peeling dell'epidermide, o microdissezione laser, consentirebbe uno studio trascrittomico e proteomico più mirato delle risposte dell'ospite.
Questo metodo aiuterà i ricercatori a determinare in modo più efficiente i fenotipi di infezione da muffa da polvere e quindi dovrebbe facilitare studi funzionali più efficaci sulle interazioni dell'oidio delle piante.
