El mildiú polvoriento es una enfermedad importante de las plantas. La determinación precisa del fenotipo de la enfermedad requiere incluso la inoculación del patógeno. Dado que los métodos existentes son ineficientes, hemos desarrollado este protocolo.
Nuestro método de inoculación de esporas puede lograr fácilmente una inoculación uniforme, y es simple y escalable. Por lo tanto, cualquier laboratorio que trabaje con mildiú polvoriento puede usar fácilmente este método. Los investigadores también pueden montar malla sobre una caja de cartón y usarla para la inoculación de esporas.
Cómo desalojar las esporas y cepillarlas a través de la malla es un paso crítico. Así que demostrar esto en video podría ser muy útil. Para este protocolo, obtenga un rollo de malla de membrana de nylon de 50 micrómetros o malla de acero inoxidable de 48 micrómetros.
Corte madera contrachapada de tamaño grande y densidad media en trozos de 24.5X10 pulgadas y 12X10 pulgadas para hacer una caja de inoculación. Para hacer una tapa superior extraíble con una malla, corte la clavija cuadrada larga de madera en dos juegos de 26 pulgadas y 12.75 pulgadas. Pegue y clave las cuatro piezas para que quepan alrededor de la caja.
Tome láminas de acrílico y ensamble todas las hojas de acrílico en una caja, usando ocho abrazaderas de esquina. Corte una ventana de apertura de 7X2 pulgadas en la parte frontal de la lámina de acrílico de la caja. Para preparar esporas frescas de mildiú polvoriento como inóculos, cultive plantas mutantes limpias de Arabidopsis inmunocomprometidas pad4-1 en una cámara de crecimiento a 22 grados centígrados y 65% de humedad relativa durante seis a ocho semanas.
Cultive las plantas para determinar los fenotipos de infección en pisos estándar. Inocular una o la mitad de las plantas pad4-1 para construir suficientes esporas frescas de mildiú polvoriento. Cuando haya esporas frescas de plantas infectadas disponibles, mueva un plano de plantas a la caja de inoculación dentro de la cámara de inoculación para una prueba de infección.
Corte de 15 a 20 hojas de Arabidopsis muy infectadas y déjelas secar si hay agua condensada. Sostenga una o dos hojas boca abajo en una mano con un par de pinzas largas. Luego coloque ambas manos a través de la abertura de la cámara y golpee suavemente el brazo de los fórceps con un par de tijeras, mientras mueve lentamente las hojas por encima de la malla montada en la caja de inoculación.
Cepille las esporas con cepillos finos de licuadora de ventilador a través de toda la superficie de la malla en diferentes direcciones para maximizar la distribución uniforme de las esporas en las plantas. Acaricia suavemente la malla varias veces con los cepillos para sacudir las esporas atrapadas en la malla. Una vez que las esporas se asienten, saque el plano que contiene las plantas inoculadas de la caja de inoculación.
Cubra el piso con una cúpula de plástico y colóquelo en una cámara de crecimiento a 22 grados centígrados y 65% de humedad relativa. El fenotipado de la enfermedad se puede realizar a los 5 u 8 a 12 días después de la inoculación. Convierta las cajas de cartón en una caja de inoculación quitando los lados superior e inferior de la caja, pegando la esquina para reafirmarla y montando una malla de 50 micrómetros en la parte superior con pegamento.
Mueva el plano que contiene las plantas dentro de la cámara de inoculación y coloque la caja de inoculación más pequeña en la parte superior del plano para cubrir las plantas. Luego desaloje y cepille las esporas. Haga una mini caja de inoculación un poco más grande que una placa de Petri.
Guarde los platos a cuatro grados centígrados en un refrigerador hasta que los use. Corte una o dos hojas completamente expandidas de la base del pecíolo para cada planta a probar. Inserte el pecíolo de las hojas separadas en el medio de agar en un ángulo de 30 grados.
Inocular las hojas dentro de la cámara de inoculación y mover la placa con la tapa a una cámara de crecimiento. Para evaluar los fenotipos de infección, transfiera las hojas a una placa de agar MS aséptica fresca a los cuatro o cinco días después de la inoculación. Corte la base del pecíolo antes de insertar las hojas en el medio de agar fresco.
Evaluar los fenotipos de la enfermedad a los ocho o nueve días después de la inoculación. El análisis microscópico mostró una distribución uniforme de las esporas en los portaobjetos microscópicos en la parte inferior del plano. La densidad calculada de esporas, distribuidas en seis lugares diferentes después de las inoculaciones ligeras, no mostró diferencias significativas.
Se lograron resultados similares después de fuertes inoculaciones con esporas. La uniformidad de la inoculación se examinó entre diferentes genotipos de plantas a los 12 días después de la inoculación pesada. Las plantas pad4-1 mostraron una mayor susceptibilidad a las enfermedades en comparación con Columbia 0, las plantas de tipo silvestre.
El uso de esporas frescas adecuadas, producidas alrededor de 10 días después de la inoculación, en plantas susceptibles, es importante, porque las esporas frescas son más fáciles de desalojar y más propensas a establecer la colonización. El mildiú polvoriento solo coloniza las células epidérmicas de las plantas. El aislamiento de células infectadas por mildiú polvoriento mediante la descamación de la epidermis, o microdisección con láser, permitiría un estudio transcriptómico y proteómico más específico de las respuestas del huésped.
Este método ayudará a los investigadores a determinar de manera más eficiente los fenotipos de infección por mildiú en polvo y, por lo tanto, debería facilitar estudios funcionales más efectivos sobre las interacciones del mildiú polvoriento de las plantas.
