O oídio é uma importante doença vegetal. A determinação precisa do fenótipo da doença requer até mesmo a inoculação do patógeno. Como os métodos existentes são ineficientes, desenvolvemos este protocolo.
Nosso método de inoculação de esporos pode facilmente alcançar até mesmo a inoculação, e é simples e escalável. Assim, qualquer laboratório que trabalhe com oídio pode facilmente usar este método. Os pesquisadores também podem montar malha sobre uma caixa de papelão e usá-la para inoculação de esporos.
Como desalojar esporos e escová-los através da malha é um passo crítico. Então, demonstrar isso em vídeo pode ser muito útil. Para este protocolo, obtenha um rolo de malha de membrana de nylon de 50 micrômetros ou malha de aço inoxidável de 48 micrômetros.
Corte madeira compensada de tamanho grande e de média densidade em pedaços de 24,5X10 polegadas e 12X10 polegadas para fazer uma caixa de inoculação. Para fazer uma tampa superior removível com uma malha, corte a longa cavilha quadrada de madeira em dois conjuntos de 26 polegadas e 12,75 polegadas. Cole e pregue as quatro peças para caber ao redor da caixa.
Pegue as folhas de acrílico e monte todas as folhas de acrílico em uma caixa, usando oito grampos de canto. Corte uma janela de abertura de 7X2 polegadas na parte frontal da folha de acrílico da caixa. Para preparar esporos frescos de oídio como inócula, cultive plantas mutantes limpas de Arabidopsis imunocomprometida4-1 em uma câmara de crescimento a 22 graus Celsius e 65% de umidade relativa por seis a oito semanas.
Cultive as plantas para determinar fenótipos de infecção em apartamentos padrão. Inocular uma ou metade das plantas de pad4-1 para construir esporos de oídio frescos suficientes. Quando esporos frescos de plantas infectadas estiverem disponíveis, mova um plano de plantas para a caixa de inoculação dentro da câmara de inoculação para um teste de infecção.
Corte de 15 a 20 folhas de Arabidopsis fortemente infectadas e deixe-as secar se houver água condensada. Segure uma a duas folhas de cabeça para baixo em uma mão com um par de pinças longas. Em seguida, coloque as duas mãos através da abertura da câmara e bata suavemente no braço da pinça com um par de tesouras, enquanto move lentamente as folhas acima da malha montada na caixa de inoculação.
Escove os esporos com escovas finas do liquidificador do ventilador através de toda a superfície da malha em diferentes direções para maximizar a distribuição uniforme dos esporos nas plantas. Gentilmente bata na malha algumas vezes com os pincéis para sacudir os esporos presos na malha. Uma vez que os esporos se assentam, mova para fora o plano que contém as plantas inoculadas da caixa de inoculação.
Cubra o plano com uma cúpula de plástico e coloque-o em uma câmara de crescimento a 22 graus Celsius e 65% de umidade relativa. A fenotipagem da doença pode ser realizada em 5 ou 8 a 12 dias após a inoculação. Converta caixas de papelão em uma caixa de inoculação removendo os lados superior e inferior da caixa, colando o canto para firmá-lo e montando uma malha de 50 micrômetros na parte superior com cola.
Mova o plano que contém as plantas dentro da câmara de inoculação e coloque a caixa de inoculação menor em cima do plano para cobrir as plantas. Em seguida, desaloje e escove os esporos. Faça uma mini caixa de inoculação um pouco maior que uma placa de Petri.
Guarde os pratos a quatro graus Celsius num frigorífico até à sua utilização. Corte uma ou duas folhas totalmente expandidas da base do pecíolo para cada planta a ser testada. Insira o pecíolo das folhas destacadas no meio ágar em um ângulo de 30 graus.
Inocular as folhas dentro da câmara de inoculação e mova a placa com a tampa para uma câmara de crescimento. Para avaliar os fenótipos de infecção, transfira as folhas para uma placa de ágar MS asséptica fresca aos quatro ou cinco dias após a inoculação. Corte a base do pecíolo antes de inserir as folhas no meio de ágar fresco.
Avalie os fenótipos da doença em oito ou nove dias após a inoculação. A análise microscópica mostrou distribuição uniforme de esporos nas lâminas microscópicas no fundo do plano. A densidade calculada de esporos, distribuídos em seis locais diferentes após inoculações leves, não mostrou diferenças significativas.
Resultados semelhantes foram alcançados após inoculações pesadas com esporos. A uniformidade da inoculação foi examinada entre os diferentes genótipos de plantas aos 12 dias após a inoculação pesada. As plantas pad4-1 apresentaram maior suscetibilidade a doenças em comparação com Columbia 0, as plantas do tipo selvagem.
O uso de esporos frescos adequados, produzidos em torno de 10 dias após a inoculação, em plantas suscetíveis, é importante, pois os esporos frescos são mais fáceis de desalojar e mais propensos a estabelecer colonização. O oídio coloniza apenas as células epidérmicas das plantas. O isolamento de células infectadas por oídio descascando a epiderme, ou microdissecção a laser, permitiria um estudo transcriptômico e proteômico mais direcionado das respostas do hospedeiro.
Este método ajudará os pesquisadores a determinar de forma mais eficiente os fenótipos de infecção por mofo em pó e, portanto, deve facilitar estudos funcionais mais eficazes sobre as interações de oídio vegetal.
