הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

שרירי השלד משמשים כמאגר מרכזי של חנקות אשר, לאחר הפיכתו לניטריט, משמש כמקור של NO במהלך פעילות גופנית. כאן אנו מציגים מתודולוגיה למדידת יונים אלה בשרירים וברקמות אחרות. כדי להתחיל, הכינו את תמיסת שימור החנקות או עצרו אותה על ידי שילוב של 890 מילימולאר אשלגן פריציאניד ו-118 מילימולאר n-מתיל-מאלימיד במים מזוקקים, כדי להבטיח שלא יישארו גבישים בתמיסה, ואז הוסיפו חומר פעיל שטח לא יוני ביחס של 1 ל-9 וערבבו בעדינות כדי למנוע קצף.

דלל את תמיסת העצירה ביחס של 1 ל-9 עם מים מזוקקים והוסף את תמיסת העצירה המדוללת לצינור ההומוגניזציה. לאחר מכן, הפשירו את רקמת השריר הקודמת של החולדה המבודדת והקפואה על הקרח. לאחר שהרקמה הפשירה, הסר את השומן ורקמת החיבור הנותרים משרירי השלד.

חותכים חתיכות של שריר השלד ומכתימים אותם על גזה לייבוש. שקלו את הכמות המתאימה של רקמת שריר השלד, ולאחר מכן הניחו את הרקמה שלפני המשקל בצינורות ההומוגניזציה המכילים את תמיסת העצירה. עבור הומוגניזציה בהומוגנייזר סיבובי, הנח את הצינור מסוג M המכיל את שריר השלד שנשקל מראש ותמיסת עצירה שנמדדה מראש לתוך המכונה.

הומוגניות כל דגימה פעמיים, ולאחר כל הומוגניזציה, מניחים את הצינור על הקרח מיד למשך 5 דקות כדי להתקרר. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר. החזירו את הצינור לקרח והוסיפו את הנפח המתאים של מתנול לפני המערבולת במשך 15 שניות.

הומוגניזציה של הדגימה שוב ודגירה שלה על קרח במשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה של חרוזים, מניחים את רקמת שריר השלד בצינור המכיל חרוזים והומוגניים פעמיים למשך 45 שניות במהירות הגבוהה ביותר הקיימת במכשיר. לאחר כל הומוגניזציה, מיד להניח את הצינור על קרח במשך 5 דקות כדי להתקרר, ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור, להניח את הצינור בחזרה על קרח, ולהוסיף את הנפח המתאים של מתנול לפני מערבולת במשך 15 שניות.

הומוגניזציה של הדגימה שוב למשך 45 שניות ואז דגירה על קרח במשך 30 דקות. צנטריפוגה של הדגימה, לשאוף את supernatant, ולהמשיך למדוד את רמות ניטריט וניטרט. עבור הומוגניזציה מבוססת pulverizer, להכין צינורות המכילים את תמיסת עצירה מדולל, ולאחר מכן לשקול ולרשום את המשקל של הצינורות.

לאחר קירור כלי הפולברייזר על קרח יבש למשך 30 דקות, באמצעות פינצטה מקוררת בחנקן נוזלי, מעבירים את דגימת הרקמה שנשקלה מראש לפולברייזר, ואז מוסיפים כמות קטנה של חנקן נוזלי כדי להבטיח שהרקמה נמצאת בטמפרטורת חנקן נוזלי. לאחר ש-95% מהחנקן הנוזלי התאדה, הניחו את כלי הריסוק על גבי הרקמה ולחצו בחוזקה כדי להרגיש את ריסוק הדגימה, ואז באמצעות מאלט, היכו בכלי הריסוק 3 עד 5 פעמים. כאשר כל הדגימה כבר pulverized, באמצעות כף נוזלית מקורר חנקן פינצטה, ישירות להעביר את הרקמה המרוסקת לתוך צינור ששקל מראש המכיל את תמיסת עצירה מדולל.

לאחר מכן, מערבל את הצינור במשך 15 שניות, ולאחר מכן לפתוח את הצינור כדי לבדוק אם כל רקמה תקועה במכסה. אם יש, נסה להיפטר ממנו, ואז מערבולת שוב. צנטריפוגה קצרה של הדגימה למשך 2 עד 3 שניות.

שקלו שוב את הצינור וחשבו את משקל הרקמה על ידי ניכוי משקל הצינור המקורי ממשקל חדש זה. מניחים את הצינור על קרח. הוסיפו נפח מתאים של מתנול לצינור ומערבבים את הצינור ביסודיות למשך 15 שניות לפני הדגירה שלו על קרח למשך 30 דקות, ואז עשו צנטריפוגה לדגימה, שאפו את הסופר-נטנט והמשיכו למדידת רמות הניטריט והחנקה.

רמות החנקות וההומוגנטים בשרירי השלד של חולדות שהוכנו באמצעות הומוגנייזר סיבובי, הומוגנייזר חרוזים ופולברייזר היו דומים. באופן מעניין, עבור רמות ניטריט, הדגימה ההומוגנית שהוכנה על ידי pulverizer הראתה את הערך הגבוה ביותר, שהיה שונה סטטיסטית משני ערכי המדגם האחרים. השוואה של רמות ניטריט וניטרט בהומוגנטים של גלוטאוס שהוכנו מ-20, 50 ו-200 מיליגרם של רקמה באמצעות הומוגנייזר חרוזים הראתה כי רמות הניטראט או הניטריט לא היו שונות באופן משמעותי בין גודל דגימת השריר.

השוואת רמות החנקות ברקמות שונות של שרירי שלד ברגליים של מכרסמים גילתה כי בשריר הגלוטאוס היו רמות חנקה גבוהות בערך פי שניים משלוש רקמות השריר האחרות. עם זאת, הבדלים אלה לא הגיעו למובהקות סטטיסטית. בדומה לרמות החנקות, גם ריכוז החנקות בשריר הגלוטאוס היה גבוה מזה שבשלוש רקמות השריר האחרות והיה גבוה משמעותית מזה שבדגימה של גסטרוקנמיוס.

השיטה שלנו פשוטה יחסית ומתאימה לדגימות קטנות תוך שמירה על ניטראט וניטריט במהלך הכנת הדגימה.