אנו מודים פרופ &#39;וינוגרדוב וד&quot;ר ורה Grivennikova עבור המבוא של המחברים לתחום הביולוגיה המיטוכונדריה תובנות ועצות שימושיות רבות בהליך זה. המחברים מודים לגברת אמנדה McKintock ממשרד התקשורת מאוניברסיטת קווינס על העזרה בהכנת וידאו.

הקדמה המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף החומרים התאי. הם ניתן להשיג במהירות ובאופן אמין בכמות גדולה מן סוג בר או עקום החוצה וחיות. הנוהל הכללי מורכב לעיכול רקמת על ידי חלוקה טריפסין, ו צנטריפוגה ההפרש. ישנם כמה תנאים שצריכים להישמר במהלך בידוד של המיטוכונדריה מרקמות שונות, כולל הלב (איור 1). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת צריך להיות טחון היטב, שכן הוא משפיע ישירות על תשואה של המיטוכונדריה שהושגו. רקמת הלב עדיף לקצץ במספריים מעוגלים קטנים ניתן ואחריו להשתמש במטחנת רקמות Latapie או, אם מטחנת רקמה אינו זמין, עיתונאים שום בקוטר מוצא חורים בקוטר של כ 1.0 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הכרחי כדי לשמור על טמפרטורה של פתרונות בכל שלב. לכן התהליך כולו צריך להתבצע בחדר קר, וכל המכשירים פתרונות להיות מוכן ומקורר מראש. אם תנאי הטמפרטורה לא נשמרים מספר מאפיינים יציבים של התכשיר ניתן לאיבוד. מבנה מיטוכונדריאלי רגיש מאוד הקפאת כך overfreezing של ההשעיה (למשל במהלך צנטריפוגה) אינה מותרת, במיוחד אם מחקרים התחבורה פעיל חשובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטר חשוב הוא הזמן הארוך של ההליך; הבידוד יש לבצע במהירות האפשרית והכנת שהושגו יש להשתמש מיד. לכן, כירורגית כלי נגינה, פתרונות ומוצרי צריכה להיות מוכנה מראש. </li></ul> חומרים ומכשירים מכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים ההפעלה סטרייט, נקודה חדה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Curved מספריים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצבטים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משפך קטן + חתיכת ניילון המסנן (prewashed) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 כוסות 50 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני stirrers מגנטי ושתי אמבטיות קרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת קרח גדול באמבטיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מוטות מגנטיים קטנים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ומדיות עבור גלולה גירוד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ Latapie רקמות (ניתן להחליף עם העיתונות השום) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפלון זכוכית homogenisers 20ml ו 1-2ml </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פסולת כוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Eppendorf צינורות להשעיה המיטוכונדריה דגימות הסופי לקביעת חלבון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיות קרח </li></ol> פתרונות (מחושב לפי 2 חולדות): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ כביסה: 0.3 סוכרוז M, 10 HEPES מ&quot;מ (pH = 7.2), 0.2 mM EDTA (1000 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ בידוד: 0.3 סוכרוז M, HEPES 10 מ&quot;מ (pH = 7.4), 0.2 mM EDTA, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BSA (Sigma A6003) (100 מ&quot;ל שהוכן למאגר כביסה). סרום אלבומין שור ניתן להחליף על ידי פחות יקר נטול חומצה אנלוגים שומן. המאגר זהה או וריאציות שלה איזוטוני יכול לשמש חיץ Resuspending. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריפסין (Sigma T8003) פתרון: 2.5mg/ml ב 1mm HCl (0.5 מ&quot;ל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעכבי טריפסין מסויה שעועית (Sigma T9128) mg/10 6.5 מ&quot;ל של חיץ בידוד </li></ol> פרוטוקול התוכנית הכללית של ההליך מוצג באיור. 1. לבבות צריך להיות מקורר לרחוץ כביסה, חיץ רקמות חדרית נכרת, טחון homogenised במהלך הטיפול photolytic עם טריפסין. ההשעיה היא centrifuged במהירות נמוכה ואת supernatant המתקבל centrifuged שוב במהירות גבוהה יותר כדי לאסוף את המיטוכונדריה. בהתאם הניסויים המתוכננת למאגר resuspending יכול להיות מוחלף על ידי כל פתרון איזוטוני אחרים. בעלי חיים הופסקה בהתאם בבריטניה &quot;חיות (הליכים מדעיים) לחוק.&quot; על ידי נקע בצוואר הרחם בעקבות עריפת ראש. זה הכרחי כדי לחלץ את הלב מיד לאחר עריפת ראש של חיה, כך שאין עיכוב בין סיום החי מיצוי לב. אם הבידוד מקביל של הכבד המיטוכונדריה צפוי החולדות צריך להיות בצום לילה לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שלושה כוסות המכילות 40 מ&quot;ל של הצפת כביסה. מגניב אותם באמבט קרח מלח במשך 3-5 דקות לפני שתמשיך לשלב הבא. ודא שלא overfreeze אותם ולהשתמש מיד אחרי עננים של גבישי קרח מתחילים להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בית החזה של עכברוש הכרות ולחלץ את הלב. ודא חתכים קטנים ומיד להעביר את הלב פתרון הקר כקרח בכוס הראשונה. חונק את הלב כדי להסיר דם והכניס אותו לתוך הכוס השנייה. חזור על פעולה זו עבור כל הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את ליבם על הנייר את המסנן. הסר את כל הדם שומן קרוש, auricles ו fasciae ובריכת רקמת חדרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את הרקמה ונקווה במספריים מעוגלים קטנים על צלחת פטרי על קרח דק סביב 5 עד גודל החלקיקים הוא כ 1-2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את רקמות טחון לתוך העיתונות רקמות לעבוראותה דרך. שים לב כי כמות משמעותית של החומר יכול להישאר בעיתונות כך לאסוף את כל רקמת לב מהקירות התחתונה של העיתונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חומר לתוך כוס עם הצפת 50 מ&quot;ל כביסה ומערבבים. ואז לסנן את ההשעיה דרך מסנן ניילון. שטפו את הרקמה טחון על 3 פעמים עם מסנן למאגר כביסה לבטל את תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות נסחפו לתוך 20 מ&quot;ל של הצפת כביסה ולמקם אותו באמבט קרח על stirrer המגנטי. הוסף 0.5 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין תחת בחישה מתמדת להפעיל את הטיימר. הכן עוד stirrer מגנטי, אמבט קרח וכוס second 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקה ה 4 homogenise בקצרה את החלק ההשעיה על ידי שימוש בחלק קטן מצויד באופן רופף זכוכית טפלון homogeniser (10-15 מ&quot;ל) עם כמה משיכות מעלה ומטה כדי לפזר את ההשעיה. לאחר homogenisation להעביר את ההשעיה לתוך הכוס השנייה. חזור על נוהל על בדקה ה 9, כך שתוכל לבצע את homogenisation ההשעיה שתי פעמים בסך הכל. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 10 מ&quot;ל של בידוד המכיל מאגר מעכב טריפסין ו דגירה דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה שוב דרך פילטר ניילון ולשמור את תסנין. איסוף החלקיקים חלק שמאל על לסנן homogenise דקות 1 ב 15-20 מ&quot;ל של הצפת כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את homogenate עם תסנין ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 600g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסנן את supernatant שנוצר לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. הימנע זיהום על ידי גלולה ו צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה במהירות גבוהה להתעלמות supernatant ולשטוף את 2-3 פעמים גלולה עם 1 מ&quot;ל של השלכת למאגר שכבת לבנות ורכות שפת החיצונית. לשבור את גלולה עם המרית אלא למנוע את הכתם האדום של אריתרוציטים בתחתית. אם בתאי הדם יש לוס, להסיר את פיסות אדום ההשעיה לפני homogenisation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם homogeniser קטנה או לחילופין על ידי pipetting עדין. לדלל את ההשעיה עם Isolationbuffer יותר צנטריפוגות שוב במשך 15 דקות ב 8500g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant, resuspend גלולה ב Resuspending הצפת (חיץ איזוטוני של בחירה) ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך חום גלולה המכילה מיטוכונדריה שלם נשטף. Resuspend גלולה בנפח קטן מאוד של חיץ איזוטוני על פי בחירתך. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Scheme הוכחת צעד אחר צעד בהליך של בידוד של הלב חולדה המיטוכונדריה. חלק למעלה, שלבים 1-9: שיבוש רקמות, טיפול homogenisation טריפסין ו; החלק התחתון, בשלבים 10-15: צנטריפוגה ההפרש.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול מהיר מפורטות הבידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד מתואר. הכנה שהושגו יכול לשמש למחקר פונקציונלי או מבניים על bioenergetics הסלולר, מחקרים proteomic או ניתוח הדנ&quot;א המיטוכונדרי ותוכן השומנים. מחקרים Biophysical תחבורה פעילה של יונים ביניים מטבולי ניתן גם לבצע. אפשר להמשיך בתהליך ההכנה המיטוכונדריה כדי לבודד את חלקיקי submitochondrial, הממברנה החיצונית או רכיבים נפרדים לטהר של זרחון חמצוני. השיטה המתוארת הוא שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי של בידוד על ידי יעקובוס ו סאקס 1. התשואה הצפויה של המיטוכונדריה מוכן הוא כ 10-15 מ&quot;ג של חלבון לכל המיטוכונדריה לב ויחס השליטה על הנשימה Malate / גלוטמט הכנה כזה נע בין 8-12 עם הנשימה IV מדינת סביב 0.12 μmol O 2 חלבון xmin xmg -1 -1 ב 23 ° C במדיום המהווים 0.25 סוכרוז M, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM אשלגן זרחתי (pH 8.0) עם 150 מיקרומטר ADP לנשימה חניכה III המדינה (על תנאי הניסוי ותוספות המדויק, לראות נ&quot;צ . 2). תשומת לב מיוחדת יש לתת פרטים טכניים אחדים לפני תחילת ההליך בבידוד. זה חיוני כדי להשתמש לנקות צינורות פוליפרופילן או פוליקרבונט צנטריפוגות, ולכן צינורות יש לשטוף ביסודיות עם מברשת נקייה ומים חמים, אולם הטיפול אבקת צריך להישמר לכל הפחות. כמו כן, עדיף לאסוף את כל כלי זכוכית וכלי הכרחי בחדר קר יום לפני הבידוד. במהלך הבידוד בעת העברת מאגרים של צלוחיות על כוסות, תשומת לב מיוחדת а יש לתת למנוע טיפות של מי קרח לתוך הפתרונות. כאשר הטיפול ברקמות יש להדגיש כי עקירת הלב צריך להתבצע בהקדם האפשרי מאז אפילו קצרת זמן העיכוב בין עריפת ראש של החיה וקירור רקמת תביא המיטוכונדריה זוגיים חלקית. קירור מהיר ושטיפת יסודית של לבבות להסיר חיונית כדי להשיג הכנה רגילה, ללא המוגלובין NADase כדורית אדומה. טריפסין משמש השפלה חלבונים החיבור להגדיל את הרגישות של הרקמות לכפות הגז במהלך homogenisation. חשיפה ממושכת של הרקמה כדי פרוטאז יש להימנע שכן התוצאות במיטוכונדריה של איכות נחותה. לאחר centrifugations מהירות גבוהה הקירות של צינורות צנטריפוגה יש לנגב עם נייר טישו כדי להסיר כל הפיקדונות של חומר השומן שהצטבר על הקירות. עבור resuspension הסופי עדיף להשתמש בנפח נמוך של המאגר הסופי על מנת למזער אובדן של פונקציות המיטוכונדריה במהלך האחסון (150-200 μl של המאגר בכל לב). עבור מחקרים של הובלה של קטיונים divalent לא סוכני chelating חייבים להיות נוכחים לקראת הגמר המיטוכונדריה ולכן יש לשטוף כמה פעמים עם המדיום EGTA ללא בשימוש בתוך השעות הראשונות לאחר בידוד.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

הפונקציה של המיטוכונדריה בדור הסלולר של ה-ATP בתהליך של זרחון חמצוני זוכה להכרה רחבה. במהלך העשורים האחרונים חלו התקדמות משמעותית להבנתנו את הפונקציות של אחרים במיטוכונדריה מאשר הדור של אנרגיה. אלה כוללים את תפקידם אפופטוזיס, מתנהג כמו איתות האברונים, פיתוח יונקים ההזדקנות, כמו גם תרומתם תיאום בין מטבוליזם התא ובחלוקה של תאים. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מווסתת על ידי המיטוכונדריה מבוסס על שיטות חזקים בידוד וטיפול של המיטוכונדריה שלם מרקמות של חיות מעבדה. המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף חומרים התאי, כולל מחקרים על עקום החוצה וחיות. כאן אנו מתארים שיטה מהירה מפורט עבור בידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד. הכנה כזו של הלב חולדה המיטוכונדריה הוא אובייקט מצוין עבור מחקר תפקודית מבנית על bioenergetics הסלולר, הובלה של ביומולקולות, מחקרים proteomic וניתוח של דנ&quot;א, חלבונים ושומנים במיטוכונדריה.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ&quot;א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Manchester. אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ"א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

Video: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

שיטות לקביעת המחירים של גלוקוז ו חומצות שומן חמצון שבלב עכברוש העבודה המבודד

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...