פרוטוקול זה מתאר אפיון ויישום של בדיקה חדשה של שומנים פלואורסצנטיים רגישים ל- pH, ספציפית לקרומי התא, המאפשרת לחוקרים לנטר אקסו ואנדוציטוזה בתאים חיים. רוב הכתבים הקודמים דיברו על חלבון ממברנה המבוסס על חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל-pH, שהוא עקיף. כחיקוי שומנים, ND6 משתלב בקרום התא, ובכך מדווח נאמנה על סחר בקרום השומנים.
גשושית ND6 הופכת לפלואורסצנטית רק אם היא מוטמעת בסביבת הממברנה הביולוגית. עוצמת הפלואורסצנטיות של בדיקה זו מתואמת עם פרוטונציה ודה-פרוטונציה של קבוצת ראשי הפיפרזין. לכן, זה fluoresces הרבה יותר חזק ב pH נמוך יותר.
אקסוציטוזה ואנדוציטוזה הם תהליכים הנמצאים בכל מקום בבסיס ההפרשה והספיגה של מולקולות איתות רבות. לכן, ND6 יכול לשמש לחקר כמה שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא ובמדעים הביו-רפואיים. מי שידגימו את ההליך יהיו היילי, אוליבר וג'ונתן, סטודנטים מהמעבדה שלי.
התחל בהכנת תא הדמיה המאפשר בקרת טמפרטורה ופלט קלט פתרון להדמיית פלואורסצנטיות של תאים חיים. הגדר התקן ניתן לתכנות כדי להחליף את פתרונות הזילוח ולספק את הגירוי החשמלי בנקודות זמן מוגדרות במהלך ההדמיה. שקלו כמות מתאימה של ND6.
ממיסים אותו בדימתיל סולפוקסיד, ומאפשרים לו להתסיס בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הפעל את הפתרון בקצרה. סנן את תמיסת המלאי הגולמי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר אגרגטים גדולים של צבע.
באמצעות ספקטרופוטומטר נפח קונבנציונלי או מיקרו, לקבוע את ריכוז הצבע ב 405 ננומטר. לפני היישום, לדלל את תמיסת המלאי לריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר באמצעות תמיסת האמבטיה. שמור את תמיסת המלאי בטמפרטורת החדר בחושך.
הוסף תמיסת מלאי ND6 למדיום התרבית בריכוז הסופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר ודגר עליה כדי לסמן בכל מקום תאי קרום אנדוציטוזי, כגון אנדוזומים. כדי להפחית את היקף תיוג שלפוחיות סינפטיות, לדכא את הפעילות העצבית הספונטנית מבחינה פרמקולוגית. לאחר תיוג סלקטיבי של שלפוחיות סינפטיות כמתואר בכתב היד, יש להרכיב את פתק הכיסוי המכיל תאים בתא ההדמיה.
חבר את חיישן הטמפרטורה, קלט הזילוח וקצה הוואקום לתא ההדמיה. כוונן את מהירות הזילוח לכ-0.2 מיליליטר לשנייה והתחל את הזילוח של תמיסת טירודה רגילה שחוממה מראש המכילה NBQX ו-DAP5 כדי להסיר ND6 מוגזם בתרבית. כוונן את המיקוד ואתר את שדה הראייה המתאים המכיל נוירונים בריאים ומפוזרים היטב הנושאים נוירונים מחוברים.
הימנעות מאזורים המכילים דיקולואידים לא פתורים. נסה הדמיה של תאים טעונים ND6 עם זמני חשיפה שונים כדי לזהות את הגדרות ההדמיה הטובות ביותר. הגדר את פרוטוקול הגירוי והזילוח, מרווח המסגרות ומשך הזמן הכולל באמצעות המידע בכתב היד של הטקסט.
התחל את רכישת התמונה מלווה גירוי וזילוח מסונכרנים. עקוב אחר הגירוי והחלפת התמיסה במהלך ההדמיה. יש להפסיק את הזילוח לאחר סיום ההדמיה.
הסר את החלקת הכיסוי ונקה את תא ההדמיה לקראת גירסת הניסיון הבאה. גבה וצור עותק אלקטרוני של כל קובצי התמונה. בחר ופתח את תוכנית הניתוח לחילוץ נתונים.
פתח או ייבא אוסף תמונות לתוכנית הניתוח. לאחר יצירת מסיכה בינארית, השתמש בפונקציית ניתוח החלקיקים עם גודל השטח והמעגליות המתאימים כדי לבקש אזורי עניין, או ROIs, המתאימים לקרום התא, אנדוזומים, ליזוזומים או בוטונים סינפטיים. בחר ארבעה החזר השקעה ברקע באזורים נטולי תאים בשדה הראייה.
לאחר מכן שמור את כל החזר ההשקעה שנבחר. יישרו את כל המסגרות באוספי התמונות של ND6 עם קיטועי זמן. הגדר את התמונה הראשונה כהפניה ויישר אליה את השאר באמצעות רישום קשיח, אשר יקטין לכלוכים עקב נדידת XY.
לאחר מכן שמרו את אוספי התמונות המיושרים. החל את החזר ההשקעה שנשמר על אוספי תמונות ND6 מיושרים. מדוד את עוצמות הפיקסלים הממוצעות של פלואורסצנטיות ND6 עבור כל החזר השקעה בכל מסגרת בערימת התמונות.
לאחר מכן יצא את התוצאות לניתוח סטטיסטי. חשב את העוצמה הממוצעת של החזר ההשקעה ברקע כדי לקבל את רעש קו הבסיס, שיופחת מכל החזר ההשקעה שנבחר. ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הגבוהות ביותר עבור כל ROI שנבחר במהלך היישום של פתרון pH 5.5 tyrode כדי להשיג את עוצמת הפלואורסצנטיות המקסימלית, המוגדרת כ- 100% לנורמליזציה.
ממוצע שלוש העוצמות הממוצעות הנמוכות ביותר עבור כל החזר השקעה שנבחר במהלך היישום של 50 מילימולר אמוניום כלורי כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות המינימלית, המוגדרת כ- 0% לנורמליזציה. חשב את השינויים הפלואורסצנטיים היחסיים עבור כל החזר השקעה בהתבסס על העוצמות של 0% ו- 100% שלו. להפיק שינויים פלואורסצנטיים ממוצעים, קינטיקה של שינויים וערכים או תרשימים אחרים מנתוני ROI בודדים.
פונקטה פלואורסצנטית ירוקה בהירה לאורך התהליכים העצביים נראתה לאחר טעינת תאי העצב עם ND6. מתאם חזק בין עוצמות פלואורסצנטיות של ND6 ו-FM464 הצביע גם על צביעת שלפוחית סינפטית על ידי ND6. נצפתה ירידה בפלואורסצנטיות ND6 בתגובה הן לגירוי חשמלי והן לגירוי אשלגן גבוה, מה שמרמז על כך ש-ND6 שוכן בקרום השלפוחית הסינפטית וכי לומן השלפוחית הסינפטי מנוטרל במהלך השחרור.
תחת גירוי חשמלי ממצה, הטיפול ב- M beta CD הפחית באופן משמעותי את שחרור השלפוחית הסינפטית ושליפתה שנמדדו על ידי הדמיית ND, אשר הצביעה על כך שכולסטרול הממברנה מאפשר אקסוציטוזה של שלפוחית סינפטית ואנדוציטוזה. Baf A1 מנע התאוששות פלואורסצנטית של ND6 לאחר גירוי על ידי חסימה חריפה של החמצה מחדש של שלפוחיות סינפטיות שהוחזרו. הבנה בסיסית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא חובה.
תכנון קפדני של מצבים פיזיולוגיים לתמיכה בדימות תאים חיים הוא חשוב מאוד. חשוב לקבוע במדויק את ריכוז תמיסת מלאי ND. במידת האפשר, מדדו מחדש את ריכוז תמיסת המלאי לפני כל שימוש.
אנא הרחיקו אותו מאור שמש ישיר כדי למנוע הלבנת תמונות ופירוק בדיקות.
