Этот протокол описывает характеристику и применение нового pH-чувствительного флуоресцентного липидного зонда, специфичного для клеточных мембран, который позволяет исследователям контролировать экзоцитоз и эндоцитоз в живых клетках. Большинство предыдущих докладчиков говорили о мембранном белке, основанном на pH-чувствительном зеленом флуоресцентном белке, который является косвенным. Как липидно-миметический, ND6 интегрируется в клеточную мембрану и, таким образом, достоверно сообщает о транспорте липидных мембран.
Зонд ND6 становится флуоресцентным только в том случае, если он встроен в биологическую мембранную среду. Интенсивность флуоресценции этого зонда коррелирует с протонированием и депротонированием группы головок пиперазина. Таким образом, он флуоресцирует гораздо сильнее при более низком рН.
Экзоцитоз и эндоцитоз являются повсеместными процессами, лежащими в основе секреции и поглощения многих сигнальных молекул. Таким образом, ND6 может быть использован для изучения некоторых фундаментальных вопросов клеточной биологии и биомедицинских наук. Эту процедуру будут демонстрировать Хейли, Оливер и Джонатан, студенты из моей лаборатории.
Начните с подготовки камеры визуализации, которая позволяет контролировать температуру и вход раствора для флуоресцентной визуализации живых клеток. Настройте программируемое устройство для переключения перфузионных растворов и подачи электрического стимула в определенные моменты времени во время визуализации. Взвесьте соответствующее количество ND6.
Растворите его в диметилсульфоксиде и дайте ему раствориться при комнатной температуре. Затем кратковременно обработайте раствор ультразвуком. Отфильтруйте исходный раствор с помощью фильтра 0,22 микрометра для удаления крупных агрегатов красителей.
С помощью обычного или микрообъемного спектрофотометра определите концентрацию красителя на длине волны 405 нанометров. Перед применением разбавьте исходный раствор до концентрации один миллиграмм на миллилитр с помощью раствора для ванны. Храните исходный раствор при комнатной температуре в темноте.
Добавьте исходный раствор ND6 в питательную среду в конечной концентрации один микрограмм на микролитр и инкубируйте его для повсеместной маркировки эндоцитозированных мембранных компартментов, таких как эндосомы. Чтобы уменьшить степень мечения синаптических везикул, фармакологически подавляют спонтанную активность нейронов. После выборочной маркировки синаптических везикул, как описано в рукописи, установите покровное стекло, содержащее клетки, в камеру визуализации.
Подключите датчик температуры, вход перфузии и вакуумный наконечник к камере визуализации. Отрегулируйте скорость перфузии примерно до 0,2 миллилитра в секунду и начните перфузию предварительно подогретого нормального раствора тирода, содержащего NBQX и DAP5, чтобы удалить избыток ND6 в культуре. Отрегулируйте фокус и найдите соответствующее поле зрения, содержащее здоровые и хорошо распределенные нейроны, несущие связанные нейриты.
Избегание участков, содержащих неразрешенные диколлоиды. Попробуйте визуализировать загруженные ячейки ND6 с разным временем экспозиции, чтобы определить наилучшие настройки визуализации. Настройте протокол стимуляции и перфузии, интервал кадров и общую продолжительность, используя информацию в текстовой рукописи.
Начните получение изображения в сопровождении синхронизированной стимуляции и перфузии. Контролируйте стимуляцию и обмен растворами во время визуализации. Прекратите перфузию после окончания визуализации.
Снимите крышку и очистите камеру визуализации для следующего испытания. Создайте резервную копию и электронную копию всех файлов изображений. Выберите и откройте программу анализа для извлечения данных.
Откройте или импортируйте стек изображений в программу анализа. После создания бинарной маски используйте функцию анализа частиц с соответствующим размером области и круговостью, чтобы получить интересующие области, или ROI, соответствующие клеточным мембранам, эндосомам, лизосомам или синаптическим бутонам. Выберите четыре фоновых ROI в свободных от ячеек областях в поле зрения.
Затем сохраните все выбранные ROI. Выровняйте все кадры в стопках интервальной съемки ND6. Установите первое изображение в качестве эталона и выровняйте остальные по нему, используя жесткую регистрацию, которая уменьшит артефакты из-за смещения по оси XY.
Затем сохраните выровненные подборки изображений. Примените сохраненные ROI к выровненным стекам изображений ND6. Измерьте среднюю интенсивность пикселей флуоресценции ND6 для каждого ROI в каждом кадре стека изображений.
Затем экспортируйте результаты для статистического анализа. Вычислите среднюю интенсивность фоновых ROI, чтобы получить базовый шум, который будет вычтен из всех выбранных ROI. Усредните три самые высокие средние интенсивности для каждого выбранного ROI во время нанесения раствора тироде pH 5,5, чтобы получить максимальную интенсивность флуоресценции, определяемую как 100% для нормализации.
Усредните три самые низкие средние интенсивности для каждого выбранного ROI во время применения 50 миллимолярного хлорида аммония, чтобы установить минимальную интенсивность флуоресценции, определяемую как 0% для нормализации. Рассчитайте относительные изменения флуоресценции для каждого ROI на основе его собственных 0% и 100% интенсивностей. Получение средних изменений флуоресценции, кинетики изменений и других значений или графиков на основе отдельных данных ROI.
Ярко-зеленые флуоресцентные пункты вдоль нейрональных отростков были видны после загрузки нейрональных клеток ND6. Сильная корреляция между интенсивностью флуоресценции ND6 и FM464 также указывает на окрашивание синаптических везикул ND6. Наблюдалось снижение флуоресценции ND6 в ответ как на электрическую стимуляцию, так и на стимуляцию высоким уровнем калия, что позволяет предположить, что ND6 находится в мембране синаптического везикула и что просвет синаптического пузырька нейтрализуется во время высвобождения.
При исчерпывающей электростимуляции лечение М бета-КД значительно снижало высвобождение и извлечение синаптических везикул, измеренных с помощью НД-визуализации, что позволило предположить, что мембранный холестерин способствует экзоцитозу синаптических везикул и эндоцитозу. Baf A1 предотвращал восстановление флуоресценции ND6 после стимуляции, остро блокируя повторное подкисление извлеченных синаптических везикул. Базовое понимание флуоресцентной микроскопии является обязательным.
Очень важно тщательное планирование физиологических условий для поддержки визуализации живых клеток. Очень важно точно определить концентрацию исходного раствора ND. По возможности измеряйте концентрацию исходного раствора перед каждым использованием.
Пожалуйста, держите его вдали от прямых солнечных лучей, чтобы избежать фотообесцвечивания и разложения зонда.
