Ce protocole décrit la caractérisation et l’application d’une nouvelle sonde lipidique fluorescente sensible au pH, spécifique aux membranes cellulaires, qui permet aux chercheurs de surveiller l’exocytose et l’endocytose dans les cellules vivantes. La plupart des rapporteurs précédents sur la protéine membranaire basée sur la protéine de fluorescence verte sensible au pH, qui est indirecte. En tant que mimétique des lipides, ND6 s’intègre dans la membrane cellulaire, et signale ainsi fidèlement le trafic de la membrane lipidique.
La sonde ND6 ne devient fluorescente que si elle est intégrée dans un environnement de membrane biologique. L’intensité de fluorescence de cette sonde est en corrélation avec la protonation et la déprotonation du groupe de tête de pipérazine. Ainsi, il est beaucoup plus fluorescent à un pH plus bas.
L’exocytose et l’endocytose sont des processus omniprésents sous-jacents à la sécrétion et à l’absorption de nombreuses molécules de signalisation. Par conséquent, ND6 peut être utilisé pour étudier certaines questions fondamentales en biologie cellulaire et en sciences biomédicales. Haley, Oliver et Jonathan, des étudiants de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par préparer une chambre d’imagerie qui permet le contrôle de la température et la sortie d’entrée de solution pour l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes. Configurez un dispositif programmable pour commuter les solutions de perfusion et délivrer le stimulus électrique à des moments définis pendant l’imagerie. Pesez une quantité appropriée de ND6.
Dissoudre-le dans du sulfoxyde de diméthyle et laissez-le se solubiliser à température ambiante. Ensuite, sonisez brièvement la solution. Filtrer la solution brute à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les gros agrégats de colorant.
À l’aide d’un spectrophotomètre conventionnel ou microvolumique, déterminez la concentration de colorant à 405 nanomètres. Avant l’application, diluer la solution mère à une concentration d’un milligramme par millilitre à l’aide de la solution de bain. Conservez la solution mère à température ambiante dans l’obscurité.
Ajouter une solution mère de ND6 au milieu de culture à la concentration finale d’un microgramme par microlitre et l’incuber pour marquer de manière omniprésente les compartiments membranaires endocytosés, tels que les endosomes. Pour réduire l’étendue du marquage des vésicules synaptiques, supprimer l’activité neuronale spontanée pharmacologiquement. Après avoir marqué sélectivement les vésicules synaptiques comme décrit dans le manuscrit, montez la lamelle contenant les cellules dans la chambre d’imagerie.
Connectez le capteur de température, l’entrée de perfusion et l’embout à vide à la chambre d’imagerie. Ajustez la vitesse de perfusion à environ 0,2 millilitre par seconde et commencez la perfusion d’une solution de tyrode normale préchauffée contenant du NBQX et du DAP5 pour éliminer l’excès de ND6 dans la culture. Ajustez la mise au point et localisez le champ de vision approprié contenant des neurones sains et bien répartis portant des neurites connectées.
Éviter les zones contenant des dicolloïdes non résolus. Essayez d’imager des cellules chargées de ND6 avec des temps d’exposition différents pour identifier les meilleurs paramètres d’imagerie. Configurez le protocole de stimulation et de perfusion, l’intervalle de cadre et la durée totale à l’aide des informations contenues dans le manuscrit textuel.
Démarrez l’acquisition d’images accompagnée d’une stimulation et d’une perfusion synchronisées. Surveillez la stimulation et l’échange de solution pendant l’imagerie. Arrêtez la perfusion une fois l’imagerie terminée.
Retirez la lamelle et nettoyez la chambre d’imagerie pour le prochain essai. Sauvegardez et faites une copie électronique de tous les fichiers image. Choisissez et ouvrez le programme d’analyse pour l’extraction des données.
Ouvrez ou importez une pile d’images dans le programme d’analyse. Après avoir généré un masque binaire, utilisez la fonction d’analyse des particules avec une taille de zone et une circularité appropriées pour solliciter des régions d’intérêt, ou ROI, correspondant aux membranes cellulaires, aux endosomes, aux lysosomes ou aux boutons synaptiques. Sélectionnez quatre zones d’intérêt d’arrière-plan dans des régions sans cellule dans le champ de vision.
Enregistrez ensuite tous les retours sur investissement sélectionnés. Alignez toutes les images dans les piles d’images time-lapse ND6. Définissez la première image comme référence et alignez le reste sur celle-ci à l’aide d’un alignement rigide, ce qui atténuera les artefacts dus à la dérive XY.
Enregistrez ensuite les piles d’images alignées. Appliquez les ROI enregistrés aux piles d’images ND6 alignées. Mesurez les intensités moyennes des pixels de la fluorescence ND6 pour chaque retour sur investissement dans chaque image de la pile d’images.
Exportez ensuite les résultats pour une analyse statistique. Calculez l’intensité moyenne des ROI de fond pour obtenir le bruit de base, qui sera soustrait de tous les ROI sélectionnés. Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus élevées pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de la solution de tyrode pH 5,5 pour obtenir l’intensité de fluorescence maximale, définie à 100 % pour la normalisation.
Faites la moyenne des trois intensités moyennes les plus faibles pour chaque retour sur investissement sélectionné lors de l’application de chlorure d’ammonium de 50 millimolaires pour définir l’intensité de fluorescence minimale, définie à 0 % pour la normalisation. Calculez les changements de fluorescence relatifs pour chaque retour sur investissement en fonction de ses propres intensités de 0 % et 100 %. Dérivez les changements de fluorescence moyens, la cinétique des changements et d’autres valeurs ou tracés à partir des données de retour sur investissement individuelles.
Des points fluorescents vert vif le long des processus neuronaux étaient visibles après le chargement des cellules neuronales avec ND6. Une forte corrélation entre les intensités de fluorescence ND6 et FM464 suggère également une coloration des vésicules synaptiques par ND6. Une diminution de la fluorescence du ND6 a été observée en réponse à la fois à la stimulation électrique et à une stimulation élevée du potassium, ce qui suggère que le ND6 réside dans la membrane de la vésicule synaptique et que la lumière de la vésicule synaptique est neutralisée lors de la libération.
Sous une stimulation électrique exhaustive, le traitement par CD bêta M a considérablement réduit la libération et la récupération des vésicules synaptiques mesurées par imagerie ND, ce qui suggère que le cholestérol membranaire facilite l’exocytose et l’endocytose des vésicules synaptiques. Baf A1 a empêché la récupération de la fluorescence ND6 après stimulation en bloquant de manière aiguë la réacidification des vésicules synaptiques récupérées. Une compréhension de base de la microscopie à fluorescence est indispensable.
Il est très important de planifier soigneusement les conditions physiologiques pour soutenir l’imagerie des cellules vivantes. Il est crucial de déterminer avec précision la concentration de la solution mère de ND. Si possible, remesurez la concentration de la solution mère avant chaque utilisation.
Veuillez le garder à l’abri de la lumière directe du soleil pour éviter le blanchiment des photos et la décomposition de la sonde.
