Este protocolo descreve a caracterização e aplicação de uma nova sonda lipídica fluorescente sensível ao pH, específica para membranas celulares, que permite aos pesquisadores monitorar exo e endocitose em células vivas. A maioria dos repórteres anteriores sobre a proteína de membrana baseada na proteína de fluorescência verde sensível ao pH, que é indireta. Como um mimético lipídico, ND6 integrar-se na membrana celular, e, assim, relatar fielmente o tráfego de membrana lipídica.
A sonda ND6 torna-se fluorescente somente se embutida em ambiente de membrana biológica. A intensidade de fluorescência dessa sonda correlaciona-se com a protonação e desprotonação do grupo cabeça da piperazina. Assim, ele fluoresce muito mais forte em pH mais baixo.
A exocitose e a endocitose são processos ubíquos subjacentes à secreção e captação de muitas moléculas sinalizadoras. Portanto, o ND6 pode ser usado para estudar algumas questões fundamentais na biologia celular e nas ciências biomédicas. Quem demonstrará o procedimento serão Haley, Oliver e Jonathan, alunos do meu laboratório.
Comece preparando uma câmara de imagem que permita o controle de temperatura e a saída de entrada de solução para imagens de fluorescência de células vivas. Configure um dispositivo programável para alternar as soluções de perfusão e fornecer o estímulo elétrico em pontos de tempo definidos durante a aquisição de imagens. Pesar uma quantidade adequada de ND6.
Dissolva-o em sulfóxido de dimetilo e deixe-o solubilizar à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar a solução brevemente. Filtre a solução-mãe bruta usando um filtro de 0,22 micrômetro para remover grandes agregados de corante.
Usando um espectrofotômetro convencional ou de microvolume, determine a concentração do corante a 405 nanômetros. Antes da aplicação, diluir a solução-mãe para uma concentração de um miligrama por mililitro usando a solução de banho. Manter a solução-mãe à temperatura ambiente no escuro.
Adicionar a solução-estoque de ND6 ao meio de cultura na concentração final de um micrograma por microlitro e incubá-lo para rotular de forma ubíqua compartimentos de membrana endocitosados, como endossomos. Para reduzir a extensão da marcação de vesículas sinápticas, suprimir farmacologicamente a atividade neuronal espontânea. Após a marcação seletiva das vesículas sinápticas, conforme descrito no manuscrito, montar a lamínula contendo células na câmara de imagem.
Conecte o sensor de temperatura, a entrada de perfusão e a ponta de vácuo à câmara de imagem. Ajustar a velocidade de perfusão para aproximadamente 0,2 mililitros por segundo e iniciar a perfusão da solução de tirode normal pré-aquecido contendo NBQX e DAP5 para remover o excesso de ND6 na cultura. Ajuste o foco e localize o campo de visão apropriado contendo neurônios saudáveis e bem espalhados com neuritos conectados.
Evitar áreas contendo dicolóides não resolvidos. Tente criar imagens de células carregadas com ND6 com diferentes tempos de exposição para identificar as melhores configurações de imagem. Estabeleça o protocolo de estimulação e perfusão, o frame interval e a duração total usando as informações do manuscrito do texto.
Iniciar a aquisição das imagens acompanhado de estimulação e perfusão sincronizadas. Monitorar a estimulação e a troca de soluções durante a aquisição de imagens. Interromper a perfusão após o término da imagem.
Remova a tampa e limpe a câmara de imagem para o próximo ensaio. Faça backup e faça uma cópia eletrônica de todos os arquivos de imagem. Escolha e abra o programa de análise para extração de dados.
Abra ou importe uma pilha de imagens para o programa de análise. Depois de gerar uma máscara binária, use a função de partícula de análise com tamanho de área e circularidade apropriados para solicitar regiões de interesse, ou ROIs, correspondentes a membranas celulares, endossomos, lisossomos ou boutons sinápticos. Selecione quatro ROIs em segundo plano em regiões livres de células dentro do campo de visão.
Em seguida, salve todos os ROIs selecionados. Alinhe todos os quadros dentro das pilhas de imagens de lapso de tempo ND6. Defina a primeira imagem como referência e alinhe o restante a ela usando registro rígido, o que atenuará artefatos devido à deriva XY.
Em seguida, salve as pilhas de imagens alinhadas. Aplique os ROIs salvos a pilhas de imagens ND6 alinhadas. Meça as intensidades médias de pixel da fluorescência ND6 para cada ROI em cada quadro da pilha de imagens.
Em seguida, exporte os resultados para análise estatística. Calcular a intensidade média das ROIs de fundo para obter o ruído basal, que será subtraído de todas as ROIs selecionadas. Média das três maiores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação da solução de tirode pH 5,5 para obtenção da intensidade máxima de fluorescência, definida como 100% para normalização.
Média das três menores intensidades médias para cada ROI selecionada durante a aplicação de cloreto de amônio de 50 milimolares para definir a intensidade mínima de fluorescência, definida como 0% para normalização. Calcule as mudanças de fluorescência relativas para cada ROI com base em suas próprias intensidades de 0% e 100%. Derive mudanças médias de fluorescência, cinética de mudança e outros valores ou gráficos a partir de dados individuais de ROI.
Pontos fluorescentes verde-brilhantes ao longo dos processos neuronais foram visíveis após a carga das células neuronais com ND6. Uma forte correlação entre as intensidades de fluorescência ND6 e FM464 também sugeriu a coloração da vesícula sináptica por ND6. Foi observada uma diminuição na fluorescência do ND6 em resposta tanto à estimulação elétrica quanto à estimulação com alto potássio, sugerindo que o ND6 reside na membrana da vesícula sináptica e que o lúmen da vesícula sináptica é neutralizado durante a liberação.
Sob uma estimulação elétrica exaustiva, o tratamento com M beta CD reduziu significativamente a liberação e recuperação da vesícula sináptica medida por imagem de DN, o que sugeriu que o colesterol de membrana facilita a exocitose e endocitose da vesícula sináptica. Baf A1 preveniu a recuperação da fluorescência ND6 após estimulação, bloqueando agudamente a reacidificação das vesículas sinápticas recuperadas. A compreensão básica da microscopia de fluorescência é imprescindível.
O planejamento cuidadoso das condições fisiológicas para dar suporte à imagem de células vivas é muito importante. É crucial determinar com precisão a concentração da solução-estoque de ND. Se possível, remedir a concentração da solução-mãe antes de cada utilização.
Por favor, mantenha-o longe da luz solar direta para evitar o clareamento fotográfico e a decomposição da sonda.
