يصف هذا البروتوكول توصيف وتطبيق مسبار دهني فلوري جديد حساس لدرجة الحموضة ، خاص بأغشية الخلايا ، والذي يسمح للباحثين بمراقبة exo و endocytosis في الخلايا الحية. معظم المراسلين السابقين على البروتين الغشائي على أساس البروتين الفلوري الأخضر الحساس لدرجة الحموضة ، وهو غير مباشر. كمحاكاة للدهون ، يندمج ND6 في غشاء الخلية ، وبالتالي يبلغ بأمانة عن تهريب الغشاء الدهني.
يصبح مسبار ND6 فلوريا فقط إذا كان مضمنا في بيئة الغشاء البيولوجي. ترتبط شدة مضان هذا المسبار بالبروتون وإزالة البروتون لمجموعة رأس البيبيرازين. وبالتالي ، فإنه يتألق أقوى بكثير عند انخفاض درجة الحموضة.
الإخراج الخلوي و endocytosis هي عمليات في كل مكان الكامنة وراء إفراز وامتصاص العديد من جزيئات الإشارة. لذلك ، يمكن استخدام ND6 لدراسة بعض الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلية والعلوم الطبية الحيوية. سيوضح الإجراء هالي وأوليفر وجوناثان ، طلاب من مختبري.
ابدأ بإعداد غرفة تصوير تسمح بالتحكم في درجة الحرارة وإخراج إدخال المحلول لتصوير مضان الخلايا الحية. قم بإعداد جهاز قابل للبرمجة لتبديل محاليل التروية وتوصيل التحفيز الكهربائي في نقاط زمنية محددة أثناء التصوير. وزن كمية مناسبة من ND6.
قم بحلها في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة. ثم صوتنة الحل لفترة وجيزة. قم بتصفية محلول المخزون الخام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة مجاميع الصبغة الكبيرة.
باستخدام مقياس الطيف الضوئي التقليدي أو الجزئي ، حدد تركيز الصبغة عند 405 نانومتر. قبل التطبيق ، قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز ملليغرام واحد لكل ملليلتر باستخدام محلول الحمام. حافظ على محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
أضف محلول مخزون ND6 إلى وسط الاستزراع عند التركيز النهائي لميكروجرام واحد لكل ميكرولتر واحتضانه لتسمية مقصورات الغشاء الداخلي في كل مكان ، مثل الإندوسومات. للحد من مدى وضع العلامات الحويصلات المشبكية ، قمع النشاط العصبي التلقائي دوائيا. بعد وضع علامات انتقائية على الحويصلات المشبكية كما هو موضح في المخطوطة ، قم بتركيب قسيمة الغطاء التي تحتوي على خلايا في غرفة التصوير.
قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة وإدخال التروية وطرف الفراغ بغرفة التصوير. اضبط سرعة التروية إلى حوالي 0.2 ملليلتر في الثانية وابدأ نضح محلول التيرود العادي المسخن مسبقا الذي يحتوي على NBQX و DAP5 لإزالة ND6 الزائد في الثقافة. اضبط التركيز وحدد مجال الرؤية المناسب الذي يحتوي على خلايا عصبية صحية ومنتشرة جيدا تحمل خلايا عصبية متصلة.
تجنب المناطق التي تحتوي على ثنائيات الغرويات التي لم يتم حلها. جرب تصوير الخلايا المحملة ب ND6 بأوقات تعرض مختلفة لتحديد أفضل إعدادات التصوير. قم بإعداد بروتوكول التحفيز والتروية ، والفاصل الزمني للإطار ، والمدة الإجمالية باستخدام المعلومات الموجودة في مخطوطة النص.
ابدأ في الحصول على الصورة مصحوبا بالتحفيز والتروية المتزامنة. راقب التحفيز وتبادل المحلول أثناء التصوير. أوقف التروية بعد انتهاء التصوير.
قم بإزالة قسيمة الغطاء ونظف حجرة التصوير للتجربة التالية. قم بعمل نسخة احتياطية وعمل نسخة إلكترونية من جميع ملفات الصور. اختر وافتح برنامج التحليل لاستخراج البيانات.
افتح أو قم باستيراد مكدس صور إلى برنامج التحليل. بعد إنشاء قناع ثنائي ، استخدم وظيفة تحليل الجسيمات مع حجم المنطقة المناسب والدائرية لالتماس مناطق الاهتمام ، أو عائد الاستثمار ، المقابلة لأغشية الخلايا ، أو الإندوسومات ، أو الجسيمات الحالة ، أو العروة المشبكية. حدد أربعة عائد استثمار في الخلفية في المناطق الخالية من الخلايا داخل مجال الرؤية.
ثم احفظ جميع عائد الاستثمار المحدد. قم بمحاذاة كل الإطارات ضمن مكدسات صور الفاصل الزمني ND6. قم بتعيين الصورة الأولى كمرجع وقم بمحاذاة الباقي إليها باستخدام تسجيل جامد ، مما سيخفف من القطع الأثرية بسبب انحراف XY.
ثم احفظ مكدسات الصور المحاذاة. قم بتطبيق عائد الاستثمار المحفوظ على مكدسات صور ND6 المحاذية. قم بقياس متوسط كثافة البكسل لمضان ND6 لكل عائد استثمار في كل إطار من حزمة الصور.
ثم تصدير النتائج للتحليل الإحصائي. احسب متوسط كثافة عائد الاستثمار في الخلفية للحصول على ضوضاء خط الأساس ، والتي سيتم طرحها من جميع عائد الاستثمار المحدد. متوسط أعلى ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق محلول التيرود pH 5.5 للحصول على أقصى شدة مضان ، والتي تعرف بأنها 100٪ للتطبيع.
متوسط أقل ثلاثة متوسط شدة لكل عائد استثمار محدد أثناء تطبيق 50 مليمول كلوريد الأمونيوم لضبط الحد الأدنى من شدة التألق ، والذي يعرف بأنه 0٪ للتطبيع. احسب التغيرات النسبية في التألق لكل عائد استثمار بناء على شدته 0٪ و 100٪. اشتق متوسط التغييرات الفلورية ، وتغيير الحركية ، والقيم أو المخططات الأخرى من بيانات عائد الاستثمار الفردية.
كانت النقاط الفلورية الخضراء الزاهية على طول العمليات العصبية مرئية بعد تحميل الخلايا العصبية ب ND6. كما اقترح وجود ارتباط قوي بين شدة مضان ND6 و FM464 تلطيخ الحويصلة المشبكية بواسطة ND6. لوحظ انخفاض في مضان ND6 استجابة لكل من التحفيز الكهربائي والتحفيز العالي للبوتاسيوم ، مما يشير إلى أن ND6 موجود في غشاء الحويصلة المشبكية وأن تجويف الحويصلة المشبكية يتم تحييده أثناء الإطلاق.
تحت التحفيز الكهربائي الشامل ، قلل علاج M beta CD بشكل كبير من إطلاق الحويصلة المشبكية واسترجاعها الذي تم قياسه بواسطة تصوير ND ، مما يشير إلى أن الكوليسترول الغشائي يسهل عملية إفراز الحويصلة المشبكية و endocytosis. منع Baf A1 استعادة مضان ND6 بعد التحفيز عن طريق منع إعادة تحمض الحويصلات المشبكية المسترجعة. الفهم الأساسي للمجهر الفلوري أمر لا بد منه.
التخطيط الدقيق للظروف الفسيولوجية لدعم تصوير الخلايا الحية مهم جدا. من الأهمية بمكان تحديد تركيز محلول مخزون ND بدقة. إذا أمكن ، أعد قياس تركيز محلول المخزون قبل كل استخدام.
يرجى الاحتفاظ بها بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة لتجنب تبييض الصور وتحلل المسبار.
