Questo protocollo descrive la caratterizzazione e l'applicazione di una nuova sonda lipidica fluorescente sensibile al pH, specifica per le membrane cellulari, che consente ai ricercatori di monitorare l'esodosi e l'endocitosi nelle cellule vive. La maggior parte dei precedenti reporter sulla proteina di membrana si basa sulla proteina di fluorescenza verde sensibile al pH, che è indiretta. Come mimetico lipidico, ND6 si integra nella membrana cellulare e quindi riporta fedelmente il traffico della membrana lipidica.
La sonda ND6 diventa fluorescente solo se incorporata in un ambiente di membrana biologica. L'intensità di fluorescenza di quella sonda è correlata con la protonazione e la deprotonazione del gruppo di testa della piperazina. Pertanto, la fluorescenza è molto più forte a pH più basso.
L'esocitosi e l'endocitosi sono processi ubiquitari alla base della secrezione e dell'assorbimento di molte molecole di segnalazione. Pertanto, ND6 può essere utilizzato per studiare alcune questioni fondamentali nella biologia cellulare e nelle scienze biomediche. A dimostrare la procedura saranno Haley, Oliver e Jonathan, studenti del mio laboratorio.
Iniziare preparando una camera di imaging che consenta il controllo della temperatura e l'uscita di ingresso della soluzione per l'imaging a fluorescenza di cellule vive. Impostare un dispositivo programmabile per commutare le soluzioni di perfusione e fornire lo stimolo elettrico in punti temporali definiti durante l'imaging. Pesare una quantità appropriata di ND6.
Scioglierlo in dimetilsolfossido e lasciarlo solubilizzare a temperatura ambiente. Quindi sonicare brevemente la soluzione. Filtrare la soluzione madre grezza utilizzando un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere gli aggregati coloranti di grandi dimensioni.
Utilizzando uno spettrofotometro convenzionale o a micro volumi, determinare la concentrazione di colorante a 405 nanometri. Prima dell'applicazione, diluire la soluzione madre a una concentrazione di un milligrammo per millilitro utilizzando la soluzione bagno. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente al buio.
Aggiungere la soluzione madre ND6 al terreno di coltura alla concentrazione finale di un microgrammo per microlitro e incubarla per marcare ubiquitariamente i compartimenti della membrana endocitosa, come gli endosomi. Per ridurre l'estensione della marcatura delle vescicole sinaptiche, sopprimere farmacologicamente l'attività neuronale spontanea. Dopo aver etichettato selettivamente le vescicole sinaptiche come descritto nel manoscritto, montare il vetrino coprioggetto contenente le cellule nella camera di imaging.
Collegare il sensore di temperatura, l'ingresso di perfusione e la punta del vuoto alla camera di imaging. Regolare la velocità di perfusione a circa 0,2 millilitri al secondo e avviare la perfusione della soluzione di tirolo normale preriscaldata contenente NBQX e DAP5 per rimuovere l'ND6 in eccesso nella coltura. Regolare la messa a fuoco e individuare il campo visivo appropriato contenente neuroni sani e ben distribuiti che portano neuriti collegati.
Evitare le aree contenenti Dicolloidi irrisolti. Provare a eseguire l'imaging di cellule caricate con ND6 con tempi di esposizione diversi per identificare le migliori impostazioni di imaging. Imposta il protocollo di stimolazione e perfusione, l'intervallo di fotogrammi e la durata totale utilizzando le informazioni contenute nel manoscritto del testo.
Avviare l'acquisizione dell'immagine accompagnata da stimolazione e perfusione sincronizzate. Monitorare la stimolazione e lo scambio di soluzioni durante l'imaging. Interrompere la perfusione al termine dell'imaging.
Rimuovere il vetrino coprioggetto e pulire la camera di imaging per la prova successiva. Eseguire il backup e creare una copia elettronica di tutti i file di immagine. Scegli e apri il programma di analisi per l'estrazione dei dati.
Aprire o importare una pila di immagini nel programma di analisi. Dopo aver generato una maschera binaria, utilizzare la funzione di analisi delle particelle con la dimensione dell'area e la circolarità appropriate per sollecitare le regioni di interesse, o ROI, corrispondenti alle membrane cellulari, agli endosomi, ai lisosomi o ai bouton sinaptici. Selezionare quattro ROI in background nelle aree prive di celle all'interno del campo visivo.
Quindi salva tutte le ROI selezionate. Allinea tutti i fotogrammi all'interno delle pile di immagini time-lapse ND6. Impostare la prima immagine come riferimento e allineare il resto ad essa utilizzando la registrazione rigida, che ridurrà gli artefatti dovuti alla deriva XY.
Quindi salva le pile di immagini allineate. Applica le ROI salvate a pile di immagini ND6 allineate. Misura l'intensità media dei pixel della fluorescenza ND6 per ogni ROI in ogni fotogramma della pila di immagini.
Quindi esporta i risultati per l'analisi statistica. Calcola l'intensità media delle ROI di fondo per ottenere il rumore di base, che verrà sottratto da tutte le ROI selezionate. Calcolare la media delle tre intensità medie più alte per ogni ROI selezionato durante l'applicazione della soluzione di pH 5,5 per ottenere la massima intensità di fluorescenza, definita come 100% per la normalizzazione.
Calcolare la media delle tre intensità medie più basse per ogni ROI selezionato durante l'applicazione di 50 millimolari di cloruro di ammonio per impostare l'intensità minima di fluorescenza, definita come 0% per la normalizzazione. Calcola le variazioni relative della fluorescenza per ogni ROI in base alle sue intensità 0% e 100%. Ricava le variazioni medie della fluorescenza, la cinetica delle variazioni e altri valori o grafici dai singoli dati ROI.
I punti fluorescenti verde brillante lungo i processi neuronali erano visibili dopo aver caricato le cellule neuronali con ND6. Una forte correlazione tra le intensità di fluorescenza di ND6 e FM464 ha anche suggerito la colorazione delle vescicole sinaptiche da parte di ND6. È stata osservata una diminuzione della fluorescenza ND6 in risposta sia alla stimolazione elettrica che alla stimolazione ad alto contenuto di potassio, suggerendo che ND6 risiede nella membrana della vescicola sinaptica e che il lume della vescicola sinaptica viene neutralizzato durante il rilascio.
Sotto un'esaustiva stimolazione elettrica, il trattamento con M beta CD ha ridotto significativamente il rilascio e il recupero delle vescicole sinaptiche misurate mediante imaging ND, il che ha suggerito che il colesterolo di membrana facilita l'esocitosi e l'endocitosi delle vescicole sinaptiche. Baf A1 ha impedito il recupero della fluorescenza ND6 dopo la stimolazione bloccando in modo acuto la riacidificazione delle vescicole sinaptiche recuperate. La conoscenza di base della microscopia a fluorescenza è un must.
Un'attenta pianificazione delle condizioni fisiologiche per supportare l'imaging di cellule vive è molto importante. È fondamentale determinare con precisione la concentrazione della soluzione madre ND. Se possibile, misurare nuovamente la concentrazione della soluzione madre prima di ogni utilizzo.
Si prega di tenerlo lontano dalla luce solare diretta per evitare lo sbiancamento della foto e la decomposizione della sonda.
