该协议描述了一种新的pH敏感荧光脂质探针的表征和应用，该探针对细胞膜具有特异性，使研究人员能够监测活细胞中的外吞和内吞作用。以往大多数报道者对膜蛋白的pH敏感绿色荧光蛋白，这是间接的。作为一种脂质模拟物，ND6 整合到细胞膜中，从而忠实地报告脂质膜运输。
ND6探针只有在嵌入生物膜环境中时才会发出荧光。该探针的荧光强度与哌嗪头部基团的质子化和去质子化相关。因此，它在较低的pH值下发出更强的荧光。
胞吐作用和内吞作用是许多信号分子分泌和摄取的普遍过程。因此，ND6可用于研究细胞生物学和生物医学科学中的一些基本问题。演示该程序的是来自我实验室的学生 Haley、Oliver 和 Jonathan。
首先准备一个成像室，该成像室允许温度控制和溶液输入输出，用于活细胞荧光成像。设置一个可编程设备来切换灌注溶液，并在成像期间的指定时间点提供电刺激。称取适量的ND6。
将其溶解在二甲基亚砜中，并在室温下溶解。然后对溶液进行简短的超声处理。使用0.22微米过滤器过滤粗储备溶液以除去大染料聚集体。
使用常规或微量分光光度计，测定 405 纳米处的染料浓度。施用前，使用浴液将储备溶液稀释至每毫升一毫克的浓度。将储备溶液保持在室温下，在黑暗中保存。
将ND6储备溶液以1微克/微升的终浓度加入培养基中，并将其孵育以普遍标记内吞膜室，例如内体。为了减少突触囊泡标记的程度，在药理学上抑制自发神经元活动。在按照手稿中的描述选择性标记突触囊泡后，将含有细胞的盖玻片安装在成像室中。
将温度传感器、灌注输入和真空吸头连接到成像室。将灌注速度调整至每秒约0.2毫升，并开始灌注含有NBQX和DAP5的预热正常酪蛋白溶液，以除去培养物中过量的ND 6。调整焦点并找到适当的视野，其中包含携带连接神经突的健康且扩散良好的神经元。
避免含有未分辨的 Dicolloids 的区域。尝试使用不同的曝光时间对 ND6 负载的细胞进行成像，以确定最佳成像设置。使用文本手稿中的信息设置刺激和灌注方案、帧间隔和总持续时间。
开始图像采集，同时进行同步刺激和灌注。监测成像过程中的刺激和溶液交换。影像学检查结束后停止灌注。
取下盖玻片并清洁成像室以进行下一次试验。备份并制作所有图像文件的电子副本。选择并打开用于数据提取的分析程序。
打开图像堆栈或将图像堆栈导入分析程序。生成二元掩模后，使用具有适当面积大小和圆度的分析粒子函数来征集对应于细胞膜、内体、溶酶体或突触布顿的感兴趣区域或 ROI。在视野内的无细胞区域中选择四个背景 ROI。
然后保存所有选定的 ROI。对齐 ND6 延时图像堆栈中的所有帧。将第一个图像设置为参考，并使用刚性配准将其余图像与该图像对齐，这将减少由于 XY 漂移引起的伪影。
然后保存对齐的图像堆栈。将保存的 ROI 应用于对齐的 ND6 图像堆栈。测量图像堆栈中每一帧中每个 ROI 的 ND6 荧光的平均像素强度。
然后导出结果进行统计分析。计算背景 ROI 的平均强度以获得基线噪声，该噪声将从所有选定的 ROI 中减去。在应用pH 5.5酪化物溶液期间，对每个选定的ROI的三个最高平均强度进行平均，以获得最大荧光强度，定义为100%进行归一化。
在应用 50 毫摩尔氯化铵期间，平均每个选定 ROI 的三个最低平均强度，以设置最小荧光强度，定义为归一化的 0%。根据每个ROI自身的0%和100%强度计算相对荧光变化。从单个 ROI 数据中推导出平均荧光变化、变化动力学和其他值或图。
在用ND6加载神经元细胞后，沿神经元过程可见亮绿色荧光点。ND6 和 FM464 荧光强度之间的强相关性也表明 ND6 对突触囊泡进行染色。在电刺激和高钾刺激下，观察到 ND6 荧光减少，表明 ND6 驻留在突触囊泡膜中，并且突触囊泡腔在释放过程中被中和。
在详尽的电刺激下，M β CD治疗显着减少了ND成像测量的突触囊泡释放和恢复，这表明膜胆固醇促进突触囊泡胞吐作用和内吞作用。Baf A1 通过急性阻断回收的突触囊泡的再酸化来阻止刺激后的 ND6 荧光恢复。对荧光显微镜有基本的了解是必须的。
仔细规划生理条件以支持活细胞成像非常重要。精确测定ND储备溶液的浓度至关重要。如果可能，请在每次使用前重新测量储备溶液浓度。
请避免阳光直射，以免照片漂白和探头分解。
