ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני ביטוי גנים הנוצרים מדגימות RNA שמקורן ב- FFPE, במיוחד בדגימות איכות תת-אופטימליות. טכניקה זו מעריכה את איכות ה- RNA בדגימות רקמת FFPE ומאפשרת אופטימיזציה של העיבוד במורד הזרם שלהם כדי לשפר את הכמות והאיכות של נתוני רצף הדגימה. שיטה זו מאפשרת אפיון מקיף של תעתיק בדגימה ביולוגית וקלינית ועשויה לספק תובנה לגבי אלמנטים תפקודיים של הגנום בהתפתחות ומחלות.
השפלת FFPE-RNA ובחירת השיטות עבור QC לדוגמה, הכנת ספריה, וניתוח נתונים יכול להיות כל מאוד מסובך. הקפד לבחור את השיטות הנכונות ואת הפקדים המתאימים. הדגמה חזותית מאפשרת לצופים להתבונן בשינויים ואמצעי הזהירות העדינים הקטנים הדרושים במהלך התכנון, ההערכה ותהליך רצף במיוחד עבור דגימות FFPE שהשתמרו בצורה גרועה.
כדי לבדוק את האיכות של מדגם RNA, להפעיל את המדגם על מערכת QC RNA על פי הוראות היצרן ולהשתמש בתוכנת bioanalysis המתאימה כדי לנתח את ההפצה של שברי RNA בתוך המדגם כדי לחשב את שיעור שברים יותר מ 100 ו 200 נוקלאוטידים. בהתבסס על מדדי QC, זהה את הדגימות עם פחות מ- 40% מהקטעים שאורךם יותר מ- 100 נוקלאוטידים כדי לאפשר אי-הכללה של דגימות אלה לעיבוד. לריקד, מפשירים את ערכות הרווקות המתאימות לפי פרמטרי הריצה באמבט מים בטמפרטורת החדר ומנחים את מגש הרייטנס בארבע מעלות צלזיוס לאחר הפשרה.
מניחים את חבילת תא הזרימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בזמן שהחבילה מתחממת, פתחו את היישום Illumina Experiment Manager ובחרו 'צור גיליון לדוגמה'. בחר את הרצף בו יש להשתמש ולחץ על הבא.
הזן את ברקוד ערכת הריג'נט ואת הפרמטרים המתאימים האחרים של זרימת העבודה. לאחר מכן העלה גיליון לדוגמה שנוצר בהתאם לקריטריוני הרצף של אילומינה. כדי להכין את הספרייה לדוגמה ואת ספריית הבקרה PhiX, denature ולדלל את הספריות לריכוזים המתאימים ולערבב את המדגם ואת ספריות הבקרה PhiX כדי לקבל יחס נפח בקרה 5%PhiX.
כאשר תאי הזרימה מוכנים, להסיר את העטיפה, לנקות את משטח הזכוכית עם לנגב אלכוהול ללא מוך, ולייבש את הזכוכית עם רקמת מעבדה מוך נמוך. הסר את מחסנית הריג'נט מאחסון של ארבע מעלות צלזיוס והפוך את המחסנית חמש פעמים כדי לערבב את הראוגנטים. הקישו בעדינות על המחסנית על הספסל כדי להפחית את בועות האוויר ולדעון את הדגימה המדולללת והמדולרת לתוך מחסנית הריג'נט במאגר המיועד.
טען את תא הזרימה, מחסנית המאגר ומחסנית הריג'נט למערכת. לאחר מכן בצע בדיקה אוטומטית וסקור את הפלט כדי להבטיח ש הפרמטרים של ההפעלה יעברו את בדיקת המערכת. לאחר השלמת הסימון האוטומטי, בחר התחל כדי להתחיל את הפעלת הריצוף.
כדי להמחיש את תוצאות QC קדם-עיבוד ו- QC לאחר יישור, הפעל מרובה QC כדי ליצור דוח מצטבר בתבנית HTML. כדי לקבוע אפקטי אצווה ולהעריך את מפת האיכות של ערכת הנתונים הנתנה, השתמש בקובץ Script של R כדי להפעיל ניתוח רכיבים ראשי. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח מתאם לדוגמה באמצעות מתאם פירסון בין דגימות שונות.
הערכת שיעור שברים ארוכים מ-100 נוקלאוטידים שימושית יותר מהערכת הקטעים שמשך זמן רב יותר מ-200 נוקלאוטידים, משום שהיא רגישה יותר למדידה מדויקת של שיעור גדלי שברים קטנים יותר עבור דגימות RNA מושפלות מאוד. בהתחשב ברמה הגבוהה של השפלה בקבוצה מדגם, שיטת הכנה הכוללת ספריית RNA מומלץ. לדוגמה, כאן מוצגות ספריות רצף שהוכנו מארבע דוגמאות שונות.
כאן מוצגות סקירות של איכות רצף קבצים גולמי של FastQ ותוכן מתאם לדוגמה. סינון FastQC יכול לעזור לזהות זיהום כגון זיהום חיידקי או עכבר בתוך הדגימות. ניתן להשתמש ביישור STAR כדי לקבוע את שיעור הקריאות הממופות לגנום הייחוס, את אחוז ההפניות הממופות באופן ייחודי לגנום הייחוס ואת שיעור ההפניות שלא מופו, או ש מופו ללוצ'י מרובים.
ניתן להשתמש בסטטיסטיקות הכרטיס וה- RSeQC כדי לקבוע את אחוז ה- RNAs של השליחים, הבסיסים האסטרוניים והבין-גניים הקיימים בקריאה הממופה. עבור ניתוחים מייצגים אלה, כמה ספריות מושפלות היו שלוש הטיה עיקרית שבה קריאות יותר מופו קרוב יותר לשלושה פריים מאשר לסוף חמשת הפריים. בנוסף, ניתוח רכיבים עיקריים יכול להתבצע כדי לקבוע את אחוז הווריאציה הכוללת שנלכדה על ידי הרכיבים העיקריים עבור השכפולים הביולוגיים של כל מדגם.
יש לדאוג כדי למנוע השפלה מדגם, להכין שכפולים ומעילים מרובים עבור כל מדגם, להשתמש במדדים המתאימים כדי להעריך את איכות המדגם, ולהשתמש בשיטת הכנת הספרייה הנכונה. באמצעות מתודולוגיה זו, מחקרי NGS גדולים יותר יכולים להתבצע עם דגימות FFPE שלא היו שמיש בעבר עם זמני אחסון ותנאי אחסון משתנים כדי לקבל תובנות על מגוון מצבי מחלה שונים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור ארכיונים גדולים קיימים של מדגם FFPE עם מידע קליני עשיר והוא יכול לשפר מאוד מחקרי סרטן מבוססי אוכלוסייה.
