המחקר של אינטראקציות חלבון חלבון מספק הבנה של הרגולציה של תהליכים ביולוגיים רבים. כאן אנו מדגימים הליך המתואר בראשון תיבות על ידי נעל Y ג'ון ושות '. עובדים בשנת 2007, שם המחברים השתמשו BiFC בשילוב עם FRET כדי לאמת את האינטראקציה המשולשת בין שלוש מולקולות חלבון.
עם זאת, כללנו מדידות לכל החיים פלואורסצנטיות בהליך זה כדי לבסס מדידות FRET. כדי להדגים אינטראקציה משולשת, בחרנו חלבון, אשר ידוע הומודימרה. יתר על כן, זה גם אומת בתוך הבית כדי לקיים אינטראקציה עם חיישן סידן של חלבון המכונה חלבון C בפרוטוקול זה.
חלבוני MNC אינטראקציה בציטופלסמה. בטכניקה זו, שני חלבונים מתויגים עם חלבוני YFP מפוצלים. האינטראקציה שלהם גורמת לפיצוי של YFP פונקציונלי הפועלים כמקבל FRET לשותף האינטראקציה השלישי, אשר מתויג עם CFP מתנהג כתורם FRET.
התחל עם הגברה של רצפי הקידוד של הגנים מעניינים שהם גנים M ו- C במקרה שלנו על ידי PCR ולשכפל אותם בווקטורים כניסה מתאימים. לאמת שיבוטים שנבחרו על אנטיביוטיקה המכילה צלחות על ידי עיכול הגבלה ורצף DNA. גייסו את תקליטורי ה- CDS המשוחזרים של שיבוטי הכניסה לווקטורי היעד.
כל הווקטורים המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלה הראשונה. לבסוף, להפוך את התאים אגרובקטריום GV3101 עם וקטורים היעד על ידי אלקטרופורציה. כאן אנו מגדלים צמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה עדיין ארבעה עד שישה שלב לעזוב בתנאים מבוקרים בתא גידול.
הכן את תערובת הקרקע על ידי ערבוב אדמה, כבול קוקו וקומפוסט ביחס של 2:1:1. מורחים שכבה בעובי 2.5 ס"מ של התערובת הזו במגש פלסטיק כדי להפוך את מיטת הקרקע ולהרוות אותה במעט מים. מפזרים כ -200 זרעים על גבי האדמה ומעבירים אותו למגש גדול יותר שקונטימטר אחד של מים עומדים.
מכסים מגש זה בניילון נצמד ליצירת תא לחות. העבר מגש זה לתא גידול שנקבע ב 23 מעלות צלזיוס עם מחזור אור של 16 שעות ושמונה שעות כהה. לאחר שבועיים מעבירים את השתילים הצעירים לסירים קטנים של 3 עד 4 אינץ', המכילים תערובת אדמה רוויה במים.
מניחים את הסירים האלה במגשי פלסטיק ומעבירים אותם לתא הגידול במשך ארבעה שבועות נוספים. עבור אגרואינפילציה, זני החיידקים צריכים להיות טריים תת-תרבית מעורב יחד עם זן P19 של אגרובקטריום ביחסים מתאימים. התחל הליך זה על ידי חנק זני אגרובקטריום GV3101 המכילים מבנים BiFC ו FRET מלוחות פסים ב 10 מ"ל.
למרק המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לצד זאת, ליזום גם תרבות של זן P19 של אגרובקטריה, אשר מתווסף כדי למנוע השתקה transgene. מכסים את הבקבוקון בנייר אלומיניום ושומרים אותם בשייקר אינקובטור, ומניחים אותו ב-28 מעלות צלזיוס ב-170 סל"ד למשך 16 שעות.
לאחר העברת הצמיחה הלילית 1 מ"ל. של תרביות אלה לתא חד פעמי כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. מערבבים את התרבויות של שותף BiFC ו- FRET מתאים המכיל זנים כך OD הסופי הוא 0.5 וזה של P19 הוא 0.3 בנפח כולל של 2 מ"ל.
כדי להשיג יחסים אלה אנו עוקבים אחר הנוסחה המוצגת על המסך עבור חישובים אלה. צנטריפוגות תרביות אגרובקטריום מעורב ב 3000G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בזהירות להשליך את supernatant. להשעות את הכדורים ב 2 מ"ל.
חוצץ חדירה. ייתכן שיהיה עליך להשתמש מערבל מערבולת להשעות מחדש את התאים בהשעיית תא הומוגני לחלוטין. לאחר מכן לדגור הצינורות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלוש שעות.
בינתיים, לתייג כל עציץ לתערובת המבנה זה הולך להיות הסתנן עם. מלאו מזרק 1 מ"ל. ללא מחט בתערובת האגרובקטריאלית.
לחץ בעדינות אך בחוזקה על קצה המזרק לצד האבקסיאלי של עלה מורחב לחלוטין תוך תמיכה בעליה מהצד השני. דוחפים בעדינות את הבוכנה עד שהתמיסה מתמלאת באזור העלה שווה ערך פי שניים עד שלושה מזה של קצה המזרק. לחדור את תערובת החיידקים עד ארבעה כתמים על עלה אחד ולחזור על הליך זה במשך שלושה עד ארבעה עלים עבור סוג אחד של חדירה.
כמו כן, לכלול לפחות שני צמחים לכל מבנה לחדירה. זכור לנגב את הידיים עם 70% אלכוהול או לשנות את הכפפות שלך כדי למנוע כל זיהום צולב. מעבירים את כל הסירים למגש ודגרה בתא הצמיחה באותו מצב צמיחה.
בדוק חלק קטן של העלה agroinfiltrated באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר הפלואורסצנטיות הן מ- YFP והן מ- CFP ניתנים לזיהוי בתאים ממשיכים למיקרוסקופ הקונפוקליבי לבדיקת BiFC FRET-FLIM. במקרה שלנו, ניתוח זה בוצע שלושה ימים לאחר סינון אגרואינפלציה.
עכשיו כשהצמחים מוכנים להמחשה תחת מיקרוסקופ חתך דגימות עלים מרובעים מחמישה עד 8 מ"מ. הרחק מפצע קצה המזרק ולהרכיב אותם על מים מזוקקים. מניחים עליו כיסוי נקי וחותמים.
דמיינו את הדגימות האלה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוצלי. בהליך זה, הבסיס לקביעת וכימות אינטראקציה בין שני חלבונים הוא הפחתת אורך החיים פלואורסצנטי של השותף התורם FRET על האינטראקציה שלה עם הקבלה, אשר משמש לחישוב היעילות של FRET. המורכבות במקרה של אינטראקציה משולשת עולה עוד יותר כי FRET מקבל במקרה זה הוא לא מולקולה אחת, אבל זוג YFP BiFC מפוצל, אשר צריך תחילה לקבל מחדש ב vivo להיות פלואורופור מקבל FRET פונקציונלי.
כדי לבצע FRET-FLIM, אנחנו צריכים לקבוע את מולקולות התורם פלורסצנטיות לכל החיים, תחילה לבד ולאחר מכן בנוכחות שותף FRET. פתח את יישום FLIM במיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי, הפעל את הקונסולה והשתמש בספירת פוטון זיהוי התבניות כדי למדוד את משך החיים של פלואורסצנטיות. בחר את מצב מדידת ספירת הפוטונים הסטנדרטי.
ניקח שני סוגים של צמחים מנודים. אחד שיש לו את הגן CCFP והשני שיש לו CCFP יחד עם MYFP מכיוון שהאינטראקציה של חלבון M כבר אומתה עם חלבון C באמצעות BiFC ו- Y2H, אנו מצפים ליעילות FRET טובה עם זוג אינטראקציה זה. עכשיו אנחנו סורקים תחילה את העלה agroinfiltrated CCFP ולחפש תא מראה פלואורסצנטיות CFP טובה.
הגדרות המיקרוסקופ מוצגות על המסך. המדגם מואר בעוצמה לייזר מספקת כדי להשיג כ 0.1 פוטונים לכל פעימה. עבור דגימות עם עוצמת פלואורסצנטיות משתנה, נתפוס 50 מסגרות כדי לאסוף פוטונים נאותים הנדרשים למדידה לכל החיים.
כפי ש- CFP ידוע כמפגין שתי תקופות חיים פלואורסצנטיות עקב ההתאמה האישורית שלו, אנו מזינים את הנתונים באמצעות מודל reconvolution מעריכי תוך שמירה על הערך של N שווה לשניים. בהגדרות אלה, שתי תקופות החיים גלויות ב- 1 ו- 3.2 ננו-שניות. אנו נשתמש לאורך החיים הגבוה יותר עבור כל החישובים הבאים.
כעת אנו מוגדרים למדוד FRET בין CCFP ו- MYFP. בשביל זה בואו להשתמש בדגימת העלים מהמפעל agroinfiltrated עם CCFP ו MYFP. אנו מחפשים תא המבטא הן CCFP והן MYFP ומאשרים את דפוסי הפליטה המתאימים שלהם על ידי מרגש אותם באמצעות לייזר דופק מלא של 40 ננומטר ולייזר אור לבן 514 ננומטר.
לאחר מכן אנו עוברים למסוף FLIM כדי למדוד את משך החיים של CFP באמצעות אותן הגדרות בהן השתמשנו קודם לכן למדידת משך החיים של CCFP. אבל הפעם התא גם מבטא MYFP שיכול לקיים אינטראקציה פוטנציאלית עם CCFP ולגרום לירידה לאורך החיים של CCFP. כפי שקראנו את הגרף שהושג באמצעות מודל reconvolution מעריכי N עם N שווה לשניים, יש למעשה ירידה תוחלת החיים CFP מ 3.2 ל 2.6 ננו שניות.
כעת אנו מפעילים את קונסולת FRET בתוכנה ומחשבים את יעילות FRET על ידי הזנת אורך חיים ללא עוררין באופן ידני במשוואה המסופקת בתוכנה ויעילות FRET הנצפית היא 56%עכשיו בואו נעבור לשלב הסופי, כלומר לדמיין את האינטראקציה בין שלושה שותפים. בשביל זה, אנחנו לוקחים את דגימת העלים מצמח כי היה בשיתוף עם CCFP ו MYFPN עם MYFPC. אנו סורקים את צמח העלים עבור תא המציג הן CFP והן פלואורסצנטיות YFP מחודשת הנובעת מאינטראקציה בין שני חלבוני M.
אנו משתמשים באותו לייזר ואורך גל פליטה כפי שהיה בשימוש קודם לכן. לאחר מכן, נכבה את לייזר 514 ננומטר ונעבור לקונסולת FLIM. אם עמעום MYFP מקיים אינטראקציה עם CCFP.
אנחנו צריכים לראות ירידה בחיים של CCFP כפי שנצפה במהלך האינטראקציה שלה עם MYFP. עם זאת, אם CCFP נכשל אינטראקציה עם DIMER MYFP, אורך החיים פלואורסצנטי שלה צריך להישאר לראות ב 3.2 ננו שניות. באמצעות ההגדרות הדומות כאמור לעיל, אנו מודדים את משך החיים של CFP בנוכחות YFP מחדש.
אנו מתאימים לגרף באמצעות מודל ההתיישבות המעריכית N עם שוויון לשניים ועוברים לקונסולת FRET. וכן, יש ירידה בתוחלת החיים של CFP מ-3.2 ל-2.3 ננו-שניות. אנו מחשבים את יעילות FRET כמתואר לעיל.
יעילות FRET המחושבת היא 55%כאן השתמשנו FLIM כדי למדוד את אורך החיים פלואורסצנטי של השותף התורם FRET בנוכחות ובהיעדר מקבל FRET. ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם הייתה צפויה אם הייתה אינטראקציה חיובית בין שני החלבונים. במקרה של שליטה חיובית, כלומר CCFP ו- MYFP.
אנו צופים ירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם מ 3.3 ל 2.5 ננו שניות ויעילות FRET היה 56%תרגיל דומה עם YFP מחדש נבע האינטראקציה בין שני אמונים וחלבוני C גם הביא אינטראקציה FRET חיובי המוביל לירידה בחיי הפלואורסצנטיות של התורם ל 2.6 ננו שניות. יעילות FRET המחושבת הייתה כ -55% במקרה זה. הירידה בחיי הפלואורסצנטיות של תורם FRET מספקת ראיה חזקה לאינטראקציה משולשת בין חלבונים אלה.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא כלי רב עוצמה כדי לקבוע אינטראקציות חלבון משולש בתאים חיים. הליך זה יכול גם לסייע בקביעת לוקליזציה תאית של מתחמי התוצאה, אשר חשוב בפענוח הפונקציה ואת המשמעות הפיזיולוגית של כל קומפלקס חלבון. לסיכום, בדיקת FRET-FLIM מבוססת BiFC מספקת הזדמנות ללמוד ולאפיין היבטים חשובים של אינטראקציות חלבון משולשות, אשר יכול להיות מועיל במחקרים אינטראקציה חלבון חלבון במערכות בעלי חיים וצמחים.
