המחברים מבקשים להודות טיפאני שרי עזרתה אופטימיזציה בפרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי להזדקנות (AG032320), כמו גם קידום ויסקונסין בריא.

עיין באיור 1 עבור סכמטית בסיסית של תחילת ההליך עם homogenate. זמן משוער של הכנת תמציות הסלולר elution של רמ&quot;א הנכנס חלבונים הוא כ 6-7 שעות. 1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק פרוסות בהיפוקמפוס organotypic בווירוס המכיל פלסמיד ביטוי חלבון רקומביננטי של עניין (בדוגמה זו, ירוק ניאון (GFP), מתויג חלבון נג) ולאפשר רקמות לבטא חלבון לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 12 עד 18 שעות לאחר ההזרקה ויראלי (תלוי בזמן ביטוי ויראלי), להכין לאסוף את הרקמה. הוסף חוצץ לנתיחה 1mL (גלוקוז 10 מ&quot;מ, 4 מ&quot;מ KCl, NaHCO3 26mM, סוכרוז 233mM, MgCl 5mm 2, 1mm CaCl 2, ו - 0.1% פנול אדום, בגז עם 5% CO 2 95% O 2) על צלחת פטרי. העברת רקמה להכניס תרבותי / צלחת פטרי ולהוסיף למאגר לנתיחה 2ml להכניס את להטביע את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקולקטיביתלא רקמה בהיפוקמפוס organotypic (בין 5 ל 10 פרוסות) על ידי מגרד בעדינות ברקמה חופשית של הממברנה להכניס באמצעות אזמל. באופן ספציפי בהסרת אזור מסוים של עניין (למשל CA1) היא גם אופציה. העברת רקמה מושעה לצינור microcentrifuge 1.5mL באמצעות הפוכה פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות RCF 1500 דקות 1 להפריד רקמה למאגר לנתיחה. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל פרוסה בשימוש, להוסיף 30-60 μL של חיץ homogenization (NaCl 150mm, 20mm טריס pH 7.5, 1mm DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, pepstatin 1μg/mL, ו -1% טריטון X -100) לרקמות ו homogenize ביסודיות עם העלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר שאריות הסלולר, בצנטריפוגה homogenate הנותרים בבית RCF 1100 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה, תוך הימנעות מזיהום של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 10% supernatant כפי מדגם של הקלט (לדוגמה 1). חנות supernatant הנותרים על הקרח במהלך תקופת ההכנה של Cam-sepharose חרוזים לשימוש בשלב 3. </li></ol> הערה: רקמה משמש כאן פרוסות בהיפוקמפוס organotypic. עם זאת, אפשר להשתמש בנוירונים ניתק או כל מערכת אחרת culturing התא. במקרה כזה, להתחיל בשלב 1.4 לאחר איסוף רקמת שלך באופן הולם. 2. הכנת חרוזי עבור הנפתח בטיפול חרוזים, חשוב להציל את החרוזים למקסם את היעילות של התגובות ידי מניעת חרוזים מהתייבשות על דפנות הצינור. כדי לעשות זאת, עדיף לסובב הצינורות שלך בצד שלהם, מה שמאפשר פתרון להרטיב את החרוזים על קירות של הצינור, מיד לפני צנטריפוגה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל הנפתח, פיפטה 400 μL של calmodulin-Sepharose חרוזים מושעה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל עם יחסית flat-התחתונה על מנת למקסם את שטח הפנים ואת האינטראקציה של פתרונות שלך עם חרוזים במהלך incubations שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים ב RCF 21,000 למשך 30 שניות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את חרוזים, להוסיף 100 μL של למאגר homogenization בהתאמה המכיל גם 2 מ&quot;מ CaCl 2 לאלה בשימוש הנפתח Ca 2 +-CAM חלבונים מחייב 2 mM EDTA (א chelator ידוע Ca 2 +) עבור חרוזים והורידה ApoCaM חלבונים מחייב. לטפוח בעדינות את הצינור מחדש להשעות חרוזים צנטריפוגות ב RCF 1500 דקות 1. הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה, מוודא שלא להפריע את החרוזים. </li></ol> הערה: כל השלבים השאיפה, מומלץ להשתמש קצה פיפטה שיש לו פתיחה נאה (למשל טעינת טיפים ג&#39;ל) כדי לאפשר הסרה של פתרון מבלי להסיר חרוזים. 3. Cam-sepharose מחייב של חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול supernatant שלך לתוך שני תנאים המכיל נפח שווה. בהתאם למצבך, להוסיף את הכמות המתאימה של CaCl 2 או EDTA עד כדי supernatant שלך ריכוז 2 מ&quot;מ כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף supernatant משלב 1.7 כדי לרחוץ במאגר חרוזים homogenization המקביל. לטפוח בעדינות את הצינור לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר. Re-להשעות חרוזים כל 30 דקות בערך כדי להגביר את היעילות של הכריכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה המכילה דגימות וחרוזים ב RCF 1500 דקות 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 50μL של supernatant כמדגם של חלבון מאוגד (מדגם 2) ו בזהירות להסיר את supernatant הנותרים על ידי שאיפה וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים שלוש פעמים כמתואר צעד 2.3 באמצעות 100μL של חיץ homogenization בהתאמה. </li></ol> 4. Elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μL של חיץ elution (50mm טריס-HCl pH 7.5, ו 150mm NaCl) המכיל את המצב ההפוך (10mm CACL 2 או 10mm EDTA) על חרוזים. לדוגמה, דגימות שהיו הומוגני וכרוך במאגר המכיל Ca 2 + הם eluted במאגר elution המכיל EDTA ולהיפך. </li></ol> אופציונלי: התחממות החיץ elution עד 37 ° C לפני הוספת חרוזים עשוי לשפר את התשואה. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פתרון עם חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות על שייקר. מערבבים בעדינות את החרוזים על ידי הקשה על הצינור על כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוזים ב RCF 1500 דקות 3 ובזהירות להסיר את 50μL של supernatant לחלבון כבול (מדגם 3) על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ טעינת חלבון לכל דגימות (כלומר, homogenate מאוגד וכרוך חלבון, כמו גם אלה עדיין קשורות עם חרוזים). </li></ol> הערה: כדי למקסם את elution (במיוחד במקרה של elution לא יעיל), להוסיף 50μL של למאגר elution המתאים (למשל הוספת buf המכיל EDTAfer כדי חרוזים כבול CaCl 2) על חרוזים לפני החימום דגימות כדי לסייע elute כל חלבון חייב הנותרים וחזור על שלבים המתוארים 4.3 להסיר חלבונים מחויב הנותרים. 5. SDS-PAGE ומערב כתם התנהגות SDS-PAGE ולנתח באמצעות כתם המערבי על ידי חיטוט לחלבון שלך עניין בדיקה של חלבון ידוע להיקשר CAM במצב ההפוך כביקורת חיובית. 6. נציג תוצאות איור 2B מראה דוגמה של assay-CAM הנפתח בדיקה מחייב CAM של NG-GFP מתויג לעומת נג אנדוגני. כדי לעשות זאת, GFP-נג היה ביטוי יתר של פרוסות בהיפוקמפוס organotypic שלנו לילה ואת רקמת היה הומוגני. Homogenate הודגר עם קאם-sepharose חרוזים בנוכחות או Ca 2 + או EDTA. הקלט Homogenate מראה כי ה-GFP-נג התבטא בנוסף נג אנדוגני Ca 2 + / CAM תלויי קינאז II(CaMKII). כצפוי מבוסס על הכריכה הידועה של נג אנדוגני (מאויר איור 2A)., GFP-tagged נג היה eluted בהעדר Ca 2 + (חלבון EDTA כבול) ו מאוגד בנוכחות Ca 2 + (איור 2B) . לעומת זאת, השליטה, CaMKII, היה eluted רק בנוכחות Ca 2 + (חלבון קשור) היה מאוגד בהעדרה (EDTA). זה מראה את החרוזים CAM תיפקדו כראוי elutions היו יעילים. והכי חשוב, זה מראה כי ה-GFP-נג נקשר ApoCaM באופן דומה לטופס אנדוגני, טוען כי את תג ה-GFP לא לשנות את הפונקציה של חלבון רקומביננטי שלנו. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="איור 1"/> 1. באיור המתאר של CAM הנפתח assay (א) homogenate רקמות הוא הסתובב כלפי מטה כדי להסיר הפסולת התאית. כ -10% supernatant הוא נלקח מדגם של הקלט (1). Supernatant הנותר מתחלק שווה בשווה עבור שונההתנאים ואת ריאגנטים המתאימים (CaCl 2 או EDTA) מתווספים מבחן מחייב בתנאים אלה. כל supernatant (המכיל גם CaCl 2 או EDTA) נטען על גבי Cam-sepharose חרוזים מוכן בהתאמה ו (ב) מודגרות לאפשר מחייב. חלבונים מאוגד מוסרים (2) ו - (ג) את החלבונים כבול (3) הם eluted off של חרוזים באמצעות חיץ elution (EB) המכיל את המצב ההפוך כאשר מחייב. הרכב החלבונים של שלושת דגימות חלבון ניתן לנתח באמצעות SDS-PAGE וניתוח המערבי כתם. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="איור 2"/> 2. איור א &#39;) סכמטי של Ca 2 + תלויות מחייב CAM ו elution ב הנפתח דוגמאות assay מקבלים שני סוגי חלבון אשר נקלטות קאם Ca 2 + תלויות בדרך. Neurogranin (נג) מייצג חלבונים הנקשרים apo-CAM ו CaMKII מייצג חלבונים אשר נקלטות על ידי Ca 2 + עשירCAM. CAM מוצג במצב שלה ניתק לפני הדגירה עם חלבונים homogenate. מודגרות לאחר בתנאי גבוה Ca 2 + ריכוזים (2 מ&quot;מ) או בנוכחות Ca 2 + chelator, EDTA (2 מ&quot;מ), חלבונים יהיה לאגד CAM בהתאם. נג נקשר CAM במצב EDTA כפי שיש לא מעט Ca 2 + בהווה, יהיה eluted את Cam-sepharose חרוזים בנוכחות Ca 2 +. CaMKII, לעומת זאת, היה לאגד CAM בנוכחות כמויות גבוהות של Ca 2 + והיה לנתק פעם + 2 Ca היה chelated. ב) תוצאות של CAM למשל הנפתח assay. נתון זה מדגים את התוצאה הסופית הצפויה של Cam-sepharose לנתץ עם דגימות נחקר במשך נג ו CaMKII. הן נג אנדוגני ו-GFP נג נמצאים בסמטאות של חלבונים חייב CAM בנוכחות EDTA. נג לא קשור כאשר דגימות מודגרת עם קאם בנוכחות Ca 2 +, הוכחת כי Nגרם בלבד נקשר apo-CAM. בקרה חיובית שלנו, CaMKII, מצד שני, נקשר CAM רק בנוכחות Ca 2 +.

<ol>
	<li>Vincenzi, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+in+the+regulation+of+intracellular+calcium.">Calmodulin in the regulation of intracellular calcium.</a> Proc. West Pharmacol Soc. 22, 289-294 (1979).</li><li>Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+calmodulin-binding+domain+of+neuromodulin,+a+neurospecific+calmodulin-binding+protein.">Identification and characterization of the calmodulin-binding domain of neuromodulin, a neurospecific calmodulin-binding protein.</a> J. Biol. Chem. 263, 7544-7549 (1988).</li><li>Huang, K. P., Huang, F. L., Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+7.5-kDa+protein+kinase+C+substrate+(RC3+protein,+neurogranin)+from+rat+brain.">Characterization of a 7.5-kDa protein kinase C substrate (RC3 protein, neurogranin) from rat brain.</a> Arch. Biochem. Biophys. 305, 570-580 (1993).</li><li>Bahler, M., Rhoads, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+signaling+via+the+IQ+motif.">Calmodulin signaling via the IQ motif.</a> FEBS Lett. 513, 107-113 (2002).</li><li>Routtenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activation+leading+to+protein+F1+phosphorylation+may+regulate+synaptic+plasticity+by+presynaptic+terminal+growth.">Protein kinase C activation leading to protein F1 phosphorylation may regulate synaptic plasticity by presynaptic terminal growth.</a> Behav. Neural. Biol. 44, 186-200 (1985).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> EMBO J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Needham, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+and+adenosinetriphosphate+in+relation+to+muscle+contraction.">Myosin and adenosinetriphosphate in relation to muscle contraction.</a> Biochim. Biophys. Acta. 4, 42-49 (1950).</li><li>Hathaway, D. R., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול בתנאי מנצל Cam-sepharose חרוזים לחקור את Ca 2 +-התלות של Cam-binding חלבונים. חלבונים רבים לאגד CAM באופן + תלויות Ca 2. אינטראקציות אלה הם בעלי חשיבות רבה בהתחשב במספר CAM מחייב חלבונים תפקיד קריטי שלהם מסלולי איתות רבים. בפרוטוקול זה, Cam-sepharose חרוזים משמשים נפ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> מוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> Calmodulin-Sepharose חרוזים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CamKII אלפא </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> טוען ג&#39;ל Pipet טיפים </td><td> דיג </td><td> 02-707-138 </td><td> השתמש השאיפה של supernatants </td></tr><tr><td> Microcentrifuge צינורות (2.0 מ&quot;ל) </td><td> דיג </td><td> 05-408-146 </td><td> השתמש עבור כל השלבים הכרוכים calmodulin-sepharose חרוזים </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

סידן (Ca 2 +) הוא יון חיוני בוויסות תפקוד הסלולר באמצעות מגוון של מנגנונים. הרבה Ca 2 + איתות מתווכת באמצעות חלבון וסידן מחייב המכונה 1,2 (רמ&quot;א) calmodulin. CAM הוא מעורב במספר רמות כמעט בכל תהליכים תאיים, כולל אפופטוזיס, חילוף החומרים, התכווצות שרירים חלקים, הפלסטיות הסינפטית, צמיחה עצב, דלקת את התגובה החיסונית. מספר חלבונים מסייעים לווסת מסלולים אלו באמצעות האינטראקציה שלהם עם קאם. רבים אינטראקציות אלה תלויים קונפורמציה של CAM, השונה במובהק כאשר חייב Ca 2 + (Ca 2 +-CAM) בניגוד למצב Ca 2 +-free שלה (ApoCaM) 3. בעוד שרוב החלבונים היעד לאגד Ca 2 +-CAM, חלבונים מסוימים רק לאגד ApoCaM. חלק CAM לאגד דרך תחום IQ שלהם, כולל 4 neuromodulin, neurogranin (נג) 5, ו myosins מסוימים <sup&gt; 6. חלבונים אלה הוכחו תפקיד חשוב בתפקוד presynaptic 7, פונקציה postsynaptic 8, 9 ו - התכווצות שרירים, בהתאמה. יכולתם לקשור ולשחרר CAM בהעדר או נוכחות של Ca 2 + הוא מכריע את תפקידם. לעומת זאת, חלבונים רבים רק לאגד Ca 2 +-CAM ודורשים זה מחייב הפעלה שלהם. דוגמאות כוללות שרירן קינאז שרשרת אור 10, Ca 2 + / CAM תלויי קינאז (CaMKs) 11 ו phosphatases (למשל calcineurin) 12, 13 ו spectrin קינאז, אשר יש מגוון של השפעות ישירות או במורד 14. ההשפעות של חלבונים אלה על תפקוד הסלולר הם בדרך כלל תלויה ביכולתם להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. לדוגמה, בדקנו את הרלוונטיות של הכריכה NG-CAM בתפקוד סינפטי וכיצד מוטציות שונות משפיעות זו מחייבת. אנחנו שנוצר קון GFP-tagged נגstruct עם מוטציות ספציפיות בתחום-IQ כי תשנה את יכולתו של נג להיקשר CAM באופן + תלויות Ca 2. המחקר של אלה מוטציות שונות נתנו לנו לרדת לעומקה של תהליכים חשובים מעורב בתפקוד סינפטי 8,15. עם זאת, מחקרים כאלה, חיוני להוכיח כי החלבונים מוטציה יש מחייב שינוי צפוי CAM. כאן, אנו מציגים שיטה לבדיקת יכולתה של חלבונים להיקשר קאם נוכחות או היעדר של Ca 2 +, באמצעות CaMKII ו נג כדוגמאות. שיטה זו היא סוג של זיקה כרומטוגרפיה המכונה assay CAM הנפתח. היא משתמשת Cam-Sepharose חרוזים לבדוק חלבונים הנקשרים CAM ואת ההשפעה של Ca 2 + על זה מחייב. זה הזמן הרבה יותר יעיל דורש פחות חלבון ביחס כרומטוגרפיה בעמודה מבחני אחרות. בסך הכל, זה מספק כלי רב ערך כדי לחקור Ca 2 + / CAM איתות וחלבונים כיteract עם קאם.

Watch this Scientific Journal Video about Pull-down of Calmodulin-binding Proteins at JoVE.com

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulin (רמ&quot;א) הנפתח assay היא דרך יעילה לחקור את האינטראקציה של CAM עם חלבונים שונים. שיטה זו משתמשת Cam-sepharose חרוזים לצורך ניתוח יעיל ספציפי של Cam-binding חלבונים. זה מספק כלי חשוב לחקור איתות קאם פונקציה הסלולר.

הנפתח של calmodulin מחייב חלבונים

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  Medical College of Wisconsin. Calmodulin (רמ"א) הנפתח assay היא דרך יעילה לחקור את האינטראקציה של CAM עם חלבונים שונים. שיטה זו משתמשת Cam-sepharose חרוזים לצורך ניתוח יעיל ספציפי של Cam-binding חלבונים. זה מספק כלי חשוב לחקור איתות קאם פונקציה הסלולר.

Video: Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

ההפרדה Electrophoretic של חלבונים

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי השמרים Methylotrophic Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).