שיטת האוטו-אינדוקציה נטולת התאים מפחיתה את הפיקוח על החוקרים ואת הזמן הדרוש להפקת תמציות תאים פונקציונליות. זה מפשט פרוטוקולים קודמים של סינתזת חלבונים במבחנה שגזלו זמן רב יותר ואינטנסיביים יותר. טכניקה זו פחות מסובכת וגם מניבה תשואה גבוהה, מה שיאפשר לקהל גדול יותר ליישם ביטוי חופשי בתאים.
שיטה זו מדגישה את החשיבות של חילוף החומרים האנרגטי במהלך גדילת התאים ובתגובות נטולות תאים. התחל על ידי הכנת 960 מיליליטרים של מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים. לאחר מכן, לעקר את התקשורת בבקבוקון מבולבל של 2.5 ליטר על ידי אוטוקלאבים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לאחר הכנת 40 מיליליטרים של תמיסת הסוכר, מסנן-לעקר אותו לתוך מיכל זכוכית אוטוקלבי נפרד. לאחר האוטוקלבינג, כאשר המדיה התרבותית התקררה אל מתחת ל-40 מעלות צלזיוס, הוסיפו את תמיסת הסוכר המעוקרת במסנן ישירות לתקשורת. לאחר מכן, חסן את התקשורת על ידי החלקת לולאה מלאה במושבות מתוך לוחית כוכב E.coli BL21 טרייה שנוסתה בעבר והחדרת הלולאה ישירות לתוך המדיה.
סובבו את הלולאה לתוך המדיה מבלי לגעת בצידי המיכל. לאחר מכן, הניחו את המדיה המחוסנת למשך הלילה בחממה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. למחרת, לקצור את התאים על ידי העברת ליטר אחד של המדיה לתוך בקבוק צנטריפוגה של ליטר אחד וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים G בין ארבע ל 10 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר השלכת הסופרנאטנט, השתמשו במרית סטרילית כדי להעביר את הכדור לצינור חרוטי מצונן מראש ושקל בעבר 50 מיליליטר. לאחר מכן, שטפו את הכדור פעם אחת עם 30 עד 40 מיליליטרים של חיץ S30 קר על ידי שימוש חוזר בכדור באמצעות מערבולות בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על קרח. לאחר שהכדור עובר החייאה מוחלטת, צנטריפוגה של החייאת התא, משליכים את הסופרנטנט, ובאמצעות רקמה נקייה, מנגבים כל סופרנטנט עודף מהקירות הפנימיים של צינור 50 מיליליטר מבלי לגעת בכדור.
לאחר מכן, שקלו את הכדור לפני שהבזק הקפיא אותו בחנקן נוזלי ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. כדי להכין את תמצית התא, הוסיפו מיליליטר אחד של חיץ S30 לגרם של גלולת התא הקפואה ואפשרו לכדור להפשיר על הקרח למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן, החזירו את הכדור המופשר באמצעות מערבולות בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על הקרח עד שלא נותרו גושי תאים נראים לעין.
עבור תזה של תאים, העבר 1.4 אליקוטים של מיליליטר של תרחיף התא לתוך צינורות מיקרופוג'ים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, נקו את תרחיף התא בכל צינור בתדר של 20 קילוהרץ ו-50% משרעת במשך שלושה התפרצויות של 45 שניות עם 59 שניות מנוחה לכל מחזור באמבטיית קרח הפוך את הצינור בין המחזורים, ולאחר מחזור הסוניקציה האחרון, הוסיפו מיד 4.5 מיקרוליטרים של דיתיותריאטול טוחן אחד. לאחר שקול תרחיף התא בכל הצינורות, צנטריפוגה של הצינורות ואספו את הסופרנטנט באליקוטים של 600 מיקרוליטר לתוך צינורות מיקרופוג'ים טריים של 1.5 מיליליטר.
פלאש להקפיא ולאחסן את aliquots במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. כדי לבצע 15 מיקרוליטרים של תגובת סינתזת חלבונים נטולי תאים בצינורות מיקרופוג' של 1.5 מיליליטר ב-quadruplicate, להפשיר אליקוט אחד של תמצית התא. לאחר הכנת כל תערובת תגובה של 15 מיקרוליטר, אפשרו לתגובה לפעול במשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
כדי לכמת את חלבון הכתב, שלבו 48 מיקרוליטרים של מאגר HEPES של 50 מילימולרי ב-pH 7.2 עם שני מיקרוליטרים של כל תוצר תגובת סינתזה של חלבון ללא תאים בצלחת פוליסטירן שחורה בעלת 96 בארות. לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של החלבון הפלואורסצנטי הירוק הסופר-פולד, או sfGFP, באמצעות אורך גל עירור של 485 ואורך גל פליטה של 528 ננומטר. לאחר מכן, המר את היחידות הפלואורסצנטיות היחסיות לתפוקה הנפחית של sfGFP על ידי יצירת עקום סטנדרטי באמצעות פלסמיד pJL1 sfGFP מטוהר.
מוצגים כאן כדורי מדיה של אוטו-אינדוקציה ללא תאים לאחר קצירת תאים בצפיפויות אופטיות שונות שנמדדו ב-600 ננומטר. המדיה שגדלה לצפיפות אופטית של 10 הפיקה כמות גבוהה יותר של כדורי תאים בתמצית הכוללת מאשר המדיה שגדלה לצפיפות אופטית של 2.5. ניתוח נוסף של ריכוז החלבון הכולל לא הראה הבדל משמעותי בחלבון הכולל בין שתי התמציות.
אף על פי שהמדיה גדלה לרמות צפיפות אופטיות שונות, שתי התמציות הדגימו תוצאות דומות בתגובות נטולות תאים המבטאות sfGFP. שמירה על תנאים סטריליים תוך הכנת תמיסת המדיה והסוכר חשובה. ניתן להשתמש בשיטת חילוץ תאים זו של CFAI עבור רוב היישומים של ביטוי חופשי לתאים.
אלה נעים בין חינוך לביוטכנולוגיה להנדסת חלבונים, כמו גם אבחון נקודתי. שיטה זו מפחיתה את משך הזמן והמיומנות הטכנית הנדרשת, משפרת את יכולת השכפול ומייצרת כמויות גבוהות יותר של תמצית.
