Hücresiz otoindüksiyon yöntemi, araştırmacı gözetimini ve fonksiyonel hücre ekstraktları üretmek için gereken zamanı azaltır. Bu, daha fazla zaman alıcı ve yoğun olan önceki in vitro protein sentez protokollerini basitleştirir. Bu teknik daha az karmaşıktır ve aynı zamanda daha büyük bir kitlenin hücresiz ifadeyi uygulamasını sağlayacak şekilde yüksek verimlidir.
Bu yöntem, hücre büyümesi sırasında ve hücresiz reaksiyonlarda enerji metabolizmasının önemini vurgulamaktadır. 960 mililitre hücresiz otoindüksiyon ortamı hazırlayarak başlayın. Daha sonra, medyayı 2,5 litrelik şaşkın bir şişede, 121 santigrat derecede 30 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
Daha sonra, 40 mililitre şeker çözeltisi hazırladıktan sonra, ayrı bir otoklavlanmış cam kaba filtreleyerek sterilize edin. Otoklavlamadan sonra, kültür ortamı 40 santigrat derecenin altına soğuduğunda, filtre sterilize edilmiş şeker çözeltisini doğrudan ortama ekleyin. Daha sonra, daha önce çizgilenmiş taze bir E.coli BL21 yıldız plakasından kolonilerle dolu bir döngüyü kaydırarak ve döngüyü doğrudan ortama yerleştirerek ortamı aşılayın.
Kabın kenarlarına dokunmadan döngüyü ortama çevirin. Ardından, aşılanmış medyayı gece boyunca 200 RPM'de sallanan 30 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün, bir litre medyayı bir litrelik santrifüj şişesine aktararak ve 10 dakika boyunca dört ila 10 santigrat derece arasında 5.000 kez G'de santrifüj yaparak hücreleri hasat edin.
Süpernatanı attıktan sonra, peleti önceden soğutulmuş ve daha önce tartılmış 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için steril bir spatula kullanın. Daha sonra, peleti bir kez 30 ila 40 mililitre soğuk S30 tamponu ile yıkayın, peleti buz üzerinde dinlenme süreleri olan 30 saniyelik patlamalarda vorteks yoluyla yeniden askıya alın. Pelet tamamen yeniden askıya alındıktan sonra, hücre yeniden süspansiyonunu santrifüj edin, süpernatanı atın ve temiz bir doku kullanarak, fazla süpernatantı pelete dokunmadan 50 mililitrelik tüpün iç duvarlarından silin.
Ardından, peleti sıvı azotta dondurulmadan önce tartın ve daha fazla kullanana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Hücre ekstraktını hazırlamak için, dondurulmuş hücre peletinin gramı başına bir mililitre S30 tamponu ekleyin ve peletin 30 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde çözülmesine izin verin. Daha sonra, çözülmüş peleti vorteks yoluyla 30 saniyelik patlamalarla yeniden askıya alın ve görünür hücre kümeleri kalmayana kadar buz üzerinde dinlenme süreleri ile yeniden askıya alın.
Hücre lizisi için, hücre süspansiyonunun 1.4 mililitrelik alikotlarını 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerine aktarın. Daha sonra, her tüpteki hücre süspansiyonunu 20 kilohertz frekansında ve% 50 genlikte% 50 genlik ile bir buz banyosunda döngü başına 59 saniye dinlenme ile üç patlama için sonikleştirin Tüpü döngüler arasında tersine çevirin ve son sonikasyon döngüsünden sonra hemen 4.5 mikrolitre bir molar dithiothreitol ekleyin. Tüm tüplerdeki hücre süspansiyonunu sonikleştirdikten sonra, tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı 600 mikrolitrelik alikotlarda taze 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerine toplayın.
Flaş dondurun ve alikotları daha fazla kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dörtlü olarak 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerinde 15 mikrolitre hücresiz protein sentez reaksiyonu gerçekleştirmek için, hücre ekstraktının bir alikotunu çözün. Her 15 mikrolitrelik reaksiyon karışımını hazırladıktan sonra, reaksiyonun 37 santigrat derecede en az dört saat çalışmasına izin verin.
Muhabir proteinini ölçmek için, pH 7.2'de 48 mikrolitre 50 milimolar HEPES tamponunu, siyah polistiren 96 delikli bir plakada her hücresiz protein sentezi reaksiyon ürününün iki mikrolitresi ile birleştirin. 485 uyarım dalga boyu ve 528 nanometre emisyon dalga boyu kullanarak süper klasör yeşil floresan proteininin veya sfGFP'nin floresan yoğunluğunu ölçün. Ardından, saflaştırılmış pJL1 sfGFP plazmidini kullanarak standart bir eğri oluşturarak bağıl floresan birimlerini sfGFP'nin hacimsel verimine dönüştürün.
Burada, 600 nanometrede ölçülen farklı optik yoğunluklarda hücre hasadından sonra hücresiz otoindüksiyon ortamı peletleri gösterilmektedir. 10 optik yoğunluğa kadar büyüyen ortam, genel ekstraktta 2.5 optik yoğunluğa kadar yetiştirilen ortamdan daha yüksek miktarda hücre peleti üretti. Toplam protein konsantrasyonunun daha ileri analizi, her iki ekstrakt arasındaki genel proteinde anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir.
Medya farklı optik yoğunluk seviyelerine yetiştirilmiş olsa da, her iki ekstrakt da sfGFP'yi ifade eden hücresiz reaksiyonlarda benzer sonuçlar göstermiştir. Ortam ve şeker çözeltisini hazırlarken steril koşulların korunması önemlidir. Bu CFAI hücre ayıklama yöntemi, hücresiz ifadenin çoğu uygulaması için kullanılabilir.
Bunlar biyoteknoloji eğitiminden protein mühendisliğine ve bakım noktası teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, gereken zaman ve teknik beceri miktarını azaltır, tekrarlanabilirliği artırır ve daha yüksek miktarda ekstrakt üretir.
