La méthode d’auto-induction sans cellule réduit la surveillance des chercheurs et le temps nécessaire pour produire des extraits cellulaires fonctionnels. Cela simplifie les protocoles précédents de synthèse de protéines in vitro qui prenaient plus de temps et étaient plus intensifs. Cette technique est moins compliquée et aussi à haut rendement, ce qui permettra à un public plus large de mettre en œuvre l’expression sans cellule.
Cette méthode souligne l’importance du métabolisme énergétique pendant la croissance cellulaire et dans les réactions sans cellules. Commencez par préparer 960 millilitres de milieux d’auto-induction sans cellules. Ensuite, stérilisez le média dans une fiole déconcertée de 2,5 litres en autoclavant pendant 30 minutes à 121 degrés Celsius.
Ensuite, après avoir préparé 40 millilitres de la solution de sucre, filtrez-stérilisez-la dans un récipient en verre autoclavé séparé. Après l’autoclavage, lorsque le milieu de culture a refroidi à moins de 40 degrés Celsius, ajoutez la solution de sucre stérilisée par filtre directement au milieu. Ensuite, inoculez le média en balayant une boucle pleine de colonies à partir d’une plaque étoilée E.coli BL21 fraîche précédemment striée et en insérant la boucle directement dans le média.
Faites tourbillonner la boucle dans le support sans toucher les côtés du récipient. Ensuite, placez le média inoculé pendant la nuit dans un incubateur de 30 degrés Celsius en secouant à 200 tr / min. Le lendemain, récoltez les cellules en transférant un litre du milieu dans une bouteille de centrifugeuse d’un litre et en centrifugant à 5 000 fois G entre quatre et 10 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Après avoir jeté le surnageant, utilisez une spatule stérile pour transférer la pastille dans un tube conique de 50 millilitres pré-refroidi et précédemment pesé. Ensuite, lavez la pastille une fois avec 30 à 40 millilitres de tampon S30 froid en resusmpant la pastille par vortex en rafales de 30 secondes avec des périodes de repos sur la glace. Une fois la pastille complètement remise en suspension, centrifugez la remise en suspension de la cellule, jetez le surnageant et, à l’aide d’un mouchoir propre, essuyez tout excès de surnageant des parois intérieures du tube de 50 millilitres sans toucher la pastille.
Ensuite, pesez la pastille avant de la congeler dans de l’azote liquide et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pour préparer l’extrait de cellule, ajoutez un millilitre de tampon S30 par gramme de granulé de cellule congelé et laissez le granulé décongeler sur la glace pendant 30 à 60 minutes. Ensuite, remettez en suspension la pastille décongelée par vortex par rafales de 30 secondes avec des périodes de repos sur la glace jusqu’à ce qu’il ne reste plus d’amas cellulaires visibles.
Pour la lyse cellulaire, transférer des aliquotes de 1,4 millilitre de la suspension cellulaire dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre. Ensuite, soniquez la suspension cellulaire dans chaque tube avec une fréquence de 20 kilohertz et une amplitude de 50% pendant trois rafales de 45 secondes avec 59 secondes de repos par cycle dans un bain de glace Inverser le tube entre les cycles, et après le dernier cycle de sonication, ajouter immédiatement 4,5 microlitres de dithiothréitol à une molaire. Après avoir soniqué la suspension cellulaire dans tous les tubes, centrifugez les tubes et collectez le surnageant dans des aliquotes de 600 microlitres dans des tubes de microfuge frais de 1,5 millilitre.
Congeler et conserver les aliquotes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Pour effectuer 15 microlitres de réaction de synthèse de protéines sans cellule dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre en quadruplicate, décongeler une aliquote de l’extrait cellulaire. Après avoir préparé chaque mélange réactionnel de 15 microlitres, laissez la réaction fonctionner pendant au moins quatre heures à 37 degrés Celsius.
Pour quantifier la protéine rapporteure, combinez 48 microlitres de tampon HEPES de 50 millimolaires à pH 7,2 avec deux microlitres de chaque produit de réaction de synthèse de protéines sans cellule dans une plaque de polystyrène noir à 96 puits. Quantifiez l’intensité de fluorescence de la protéine fluorescente verte superdosseuse, ou sfGFP, en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 485 et une longueur d’onde d’émission de 528 nanomètres. Ensuite, convertissez les unités de fluorescence relatives au rendement volumétrique de sfGFP en créant une courbe standard à l’aide du plasmide pJL1 sfGFP purifié.
On voit ici des pastilles de milieux d’auto-induction sans cellules après récolte cellulaire à différentes densités optiques mesurées à 600 nanomètres. Le milieu atteint une densité optique de 10 a produit une plus grande quantité de pastilles cellulaires dans l’extrait global que le milieu atteint une densité optique de 2,5. Une analyse plus approfondie de la concentration en protéines totales n’a montré aucune différence significative dans les protéines globales entre les deux extraits.
Même si le milieu a été cultivé à des niveaux de densité optique différents, les deux extraits ont démontré des résultats similaires dans les réactions sans cellules exprimant sfGFP. Il est important de maintenir des conditions stériles lors de la préparation du milieu et de la solution de sucre. Cette méthode d’extrait de cellule CFAI peut être utilisée pour la plupart des applications d’expression sans cellule.
Celles-ci vont de l’enseignement de la biotechnologie à l’ingénierie des protéines, en passant par le diagnostic au point de service. Cette méthode réduit le temps et les compétences techniques requises, améliore la reproductibilité et produit de plus grandes quantités d’extrait.
