פרוטוקול זה מסייע לבודד את המיקרוגליה מהנגעים הדו-מיניים של מוח העכבר הבוגר כדי לחקור את המאפיינים המיקרוגליאליים in vivo. טכניקה זו חוסכת זמן ויש לה דרישות נמוכות יותר הן לנסיינים והן לציוד. שיטה זו מסייעת לבודד מיקרוגליה ממוח החיה, במיוחד אלה רקמות microdissected במצבי מחלה שונים.
התחל על ידי מיקרו-הבחנה של הנגעים המסומנים על ידי צבע נייטרלי סביב קורפוס קלוסום תחת סטריאומיקרוסקופ. צנטריפוגה את הרקמה המנותקת ב 300 פעמים g במשך 30 שניות כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור. אנזים קדם-חימום מערבב אחד ואנזים מערבב שתיים עד 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
לאחר מכן, הוסיפו 1, 950 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים שחוממו מראש דגימה אחת לשנייה, ועכלו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים מחוממת מראש שניים, ומערבבים בעדינות. לאחר העיכול, להוסיף ארבעה מיליליטרים של PBS קר לצינור, ולנער בעדינות.
צנטריפוגה של הרקמה דוגמת ב-300 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ושואפת את הסופרנאטנט לאט ובאופן מלא. בצעו החייאה של גלולת התא בעדינות עם 1, 550 מיקרוליטרים של PBS קר. מוסיפים 450 מיקרוליטרים של הפתרון הקר להסרת פסולת, ומערבבים אותם היטב.
השתמשו בפיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לכסות את התערובת לאט מאוד, ובעדינות עם שני מיליליטרים של PBS קר. צנטריפוגה את התערובת, ולאחר מכן לחפש את שלוש השכבות. השתמש בפיפטה של 1, 000 מיקרוליטר כדי לשאוף לחלוטין את שתי השכבות העליונות, ולמלא את הצינור עד חמישה מיליליטרים עם מאגר טעינה קר.
הפכו בעדינות את הצינור שלוש פעמים. לאחר מכן, לאחר צנטריפוגה ושאיפה של הסופרנטנט, החיזרו את גלולת התא עם 90 מיקרוליטרים של מאגר טעינה, והוסיפו 10 מיקרוליטרים של חרוזי CD11b. מערבבים היטב, ודוגרים במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, הוסיפו מיליליטר אחד של מאגר ההעמסה, ושטפו את התאים על ידי צנרת עדינה של הנוזל למעלה ולמטה עם פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר. צנטריפוגה של התאים ב-300 פעמים g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ושואפים את הסופרנטנט לחלוטין כדי להסיר את החרוזים הלא מאוגדים. בצעו שימוש חוזר בתאים ב-500 מיקרוליטרים של מאגר הטעינה, והניחו את עמודת הטרשת הנפוצה עם המפריד שלה לבחירה חיובית בשדה המגנטי.
שטפו את העמודה ב-500 מיקרוליטרים של מאגר ההעמסה כדי להגן על התאים ולהבטיח את יעילות המיון המגנטי בהתבסס על פרוטוקול היצרן. החל את תרחיף התא על עמודת הטרשת הנפוצה, והשליך את הזרימה המכילה את התאים ללא תווית. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר הטעינה כדי לשטוף את העמודה ולהסיר אותה מהמפריד.
מקם את העמודה על צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, והוסף מיליליטר אחד של מאגר הטעינה לעמודה. לבסוף, דחפו את הבוכנה לתחתית העמודה כדי לשטוף החוצה את התאים המסומנים באופן מגנטי. ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הגטינג המשמשת בניתוח ציטומטריה של זרימה של מיקרוגליה שבודדה מנגעי דמילינציה של עכברים בוגרים לפני ואחרי מיון התאים המופעלים על ידי מגנטית מוצג כאן.
התמונות הגרפיות מייצגות את גובה הפיזור הקדמי ואת גובה הפיזור הצדדי לבחירת תאים, אזור פיזור קדימה וגובה פיזור קדימה לבחירת תאים בודדים, ו- CD11b-FITC ו- CD45-APC לבחירת התאים המיאלואידיים והמיקרוגליה. שיעור המיקרוגליה גדל באופן משמעותי לאחר מיון התאים המופעלים על ידי מגנטית. התמונה הגרפית מייצגת את אסטרטגיית הגטינג המשמשת בניתוח ציטומטריה של זרימה עבור תאים בודדים חיים ומתים לאחר מיון התאים המופעלים מגנטית.
כאן, 7-aminoactinomycin D וגובה פיזור צד שימשו לבחירת התאים החיים. בעת ניסיון הליך זה, זכור לנתח במדויק את הנגעים demyelinating תחת סטריאומיקרוסקופ המבוסס על סימנים אדומים ניטרליים.
