ניתן להשתמש בטכניקת שיפור ההרפיה הפאראמגנטית כדי לאפיין ולמדוד מרחקים בין-מולקולריים ולכמת אינטראקציות ביומולקולריות חולפות ו/או מאוכלסות נמוך. כאן, יישמנו טכניקה זו כדי ללכוד אינטראקציות שקדמו לעיבוי חלבונים. הרגישות של PREs מאפשרת זיהוי, גילוי וכימות של רזולוציה אטומית של מצבים דינמיים שנותרים בלתי נראים ובלתי נגישים לטכניקות NMR אחרות.
השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים הסרת תווית ספין החנקן הבלתי מצומד וניתוח זהיר של הספקטרום כדי למדוד במדויק את גובה השיא. בנוסף, יש לנקוט משנה זהירות במהלך הגדרת ניסוי NMR וכיול הדופק. כדי להתחיל, הוסף 3-maleimido-PROXYL מתמיסת מלאי בעודף מולארי פי 20 של 15N חלבון איזוטופי של עניין.
יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור וחמצן ובעזרת נדנוד או אגוז עדינים. למחרת, הסר את תווית הספין החופשי ללא תגובה כדי למנוע PRE ממס לא ספציפי באמצעות דיאליזה נרחבת של דגימת החלבון או באמצעות סינון ג'ל. לאחר מכן השתמש בריאגנט של אלמן כדי לכמת קבוצות סולפידריל חופשיות בתמיסה.
מדוד את הספיגה באמצעות קורא microplate ולבנות את העקומה הסטנדרטית. כדי למדוד PRE, הכינו ספין 15N מועשר איזוטופית בחלבון המסומן בספין לריכוז של לפחות 100 מיקרומולארי, אך לא יותר מ-300 מיקרומולארי, בחיץ המתאים ל-NMR. לאחר מכן באמצעות פיפטה מזכוכית גזע ארוכה או מיקרופיפטה, מעבירים את דגימת ה- NMR לצינור NMR של חמישה מילימטר המתאים לשימוש במגנטים בעלי שדה גבוה.
הניחו את הדגימה במגנט. נעילה על אות הדאוטריום באמצעות פקודת הנעילה וכוונון והתאמה של תעלת הפרוטון בהתאם לפרוטוקולי המתקן. לאחר מכן התאם את ה- shims באמצעות שגרת ה- shim העליונה כדי לייעל את דיכוי אות הממס.
לאחר מכן, כיילו את פולס הפרוטון באמצעות תוכנית P-OPT. לאחר מכן כיילו את פולס 15N כנגד דגימה סטנדרטית. קבע את ההנחתה הנכונה עבור פולסים מעוצבים באמצעות שגרת הכלי צורה.
לאחר מכן פתח את קובץ צורת הדופק המתאים על ידי לחיצה על סמל התיקיה. הפולסים המעוצבים נמצאים בסעיף פרמטרי הדופק של פרמטרי רכישה. לאחר טעינת קובץ הגדרת הדופק, לחצו על 'נתח צורת גל' ולאחר מכן לחצו על 'שלב צורה'.
הזן את הפרוטון המכויל בפולס קשה של 90 מעלות, את הצורה הרצויה, את אורך הדופק ואת הסיבוב. לאחר מכן חשב את רמת ההספק של הדופק המעוצב על ידי הוספת שינוי רמת הכוח להנחתה עבור הדופק המכויל של 90 מעלות. הקלט פרוטון 15N HSQC סטנדרטי כדי למטב את רוחב הטאטוא, תדירות הנשא ולבדוק את דיכוי המים.
לבסוף, התאם את רוחב הניקוי ואת מספר הפרשי הממדים העקיפים באמצעות הפקודות SW ו- TD או ישירות בתיבות הדו-שיח המתאימות. כייל את הפולסים המעוצבים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן הזן את אורכי הדופק המכוילים במקטע פרמטרי הדופק בכרטיסייה פרמטרים של רכישה.
כדי למדוד את פרוטון האמיד T2 באמצעות גישת שתי נקודות השהיית הזמן, הגדר את השהיות הזמן על-ידי עריכת קובץ הרשימה VD. ההשהיה הראשונה מוגדרת ל- 0.01 אלפיות השנייה. באמצעות הקשר ל- PRE, המרבי הצפוי, בחר את ההשהיה השנייה.
לאחר מכן קבע ערך מתאים על-ידי השוואת ההפרשים הראשונים של ספקטרום ההשהיה הראשון והשני והתאמת ההשהיה השנייה כך שהאות דועך ל-40% עד 50% מערכו ההתחלתי. קבע את מספר הנקודות המורכבות להקלטה ואת מספר הסריקות לממוצע אות מספיק. לאחר מכן השתמש בפקודה EXPT כדי לחשב את זמן הניסוי והתחל את הניסוי עם הפקודה ZG. לאחר המסת נתרן אסקורבט במאגר NMR, התאם את ה- pH כך שיתאים לזה של מאגר ה- NMR המקורי.
לאחר מכן הוסף את החומצה האסקורבית לצינור NMR בעודף מולארי פי 10 מעל ריכוז תווית הספין על ידי הנחת טיפה מתחת לשפת הצינור. מכסים את הצינור והופכים בזהירות כדי לערבב. סובבו במהירות של 200 עד 400 גרם במשך 10 עד 20 שניות בצנטריפוגה ידנית כדי ליישב את הדגימה בתחתית הצינור.
לאחר עטיפת הצינור בנייר כסף, לאפשר את התגובה להמשיך לפחות שלוש שעות. לאחר מכן רשום פרוטון אמיד T2 על הדגימה הדיאמגנטית באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לדגימה הפאראמגנטית. גמא פרוטון תוך מולקולרי אמיד PREs תועדו על מקטע בעל שיוך עצמי בעל הפרעה פנימית הנגזר מתחום הסיבוכיות הנמוכה של חלבון קושר RNA EWSR1.
שאריות בסמיכות רציפה לנקודת החיבור של תווית הספין צפויות להתרחב משמעותית ואינן ניתנות לגילוי בספקטרום. שאריות שהיו במרווחים רציפים מנקודת החיבור אך הראו גמא משופר היו קרובות מרחבית לתווית הספין. במקרה של חלבונים בעלי הפרעה מהותית, הקלטה וניתוח של מחית יניבו מידע על מגעים תוך-מולקולריים ומשטחי אינטראקציה חולפים.
שילוב מדידות PRE עם שיטות ביופיזיקליות אחרות כגון פיזור אור דינמי, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ושיטות חישוביות יכול לספק תובנות עמוקות יותר. מדידת PRE מסייעת באפיון מצב ארעי המאוכלס בדלילות. ניתן להרחיב גישה זו כדי לאפיין אינטראקציות חשובות למספר עצום של תהליכים ביולוגיים כגון זיהוי מולקולרי, ברירה קונפורמטיבית אלוסטרית ותהליכי הרכבה, כולל הרכבת אברונים חסרי קרום באמצעות הפרדת פאזות.
