A técnica de realce por relaxação paramagnética pode ser utilizada para caracterizar e medir distâncias intermoleculares e quantificar interações biomoleculares transitórias e/ou pouco povoadas. Aqui, aplicamos essa técnica para capturar interações que precedem a condensação de proteínas. A sensibilidade dos PREs permite a identificação, detecção e quantificação de resolução atômica de estados dinâmicos que permanecem invisíveis e inacessíveis a outras técnicas de RMN.
As principais etapas deste protocolo incluem a remoção da etiqueta de spin de nitroóxido não conjugado e a análise cuidadosa dos espectros para medir com precisão a altura do pico. Além disso, deve-se ter cautela durante a instalação do experimento de RMN e calibração do pulso. Para começar, adicione 3-maleimido-PROXYL de uma solução estoque a 20 vezes o excesso molar da proteína marcada isotopicamente 15N de interesse.
Incubar durante a noite à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius protegido da luz e do oxigénio e com balanço suave ou nutação. No dia seguinte, remova o rótulo de spin livre não reagido para evitar PRE de solvente não específico usando diálise extensiva da amostra de proteína ou filtração em gel. Em seguida, use o reagente de Ellman para quantificar grupos sulfidrila livres na solução.
Meça a absorbância usando um leitor de microplacas e construa a curva padrão. Para medir a PRE intramolecular, preparar proteína marcada com spin isotopicamente enriquecida com 15N para uma concentração de pelo menos 100 micromolares, mas não superior a 300 micromolares, em um tampão adequado para RMN. Em seguida, usando uma pipeta de vidro de haste longa ou micropipeta, transfira a amostra de RMN para um tubo de RMN de cinco milímetros apropriado para uso em ímãs de alto campo.
Coloque a amostra no ímã. Bloqueie o sinal de deutério usando o comando lock e sintonize e combine o canal de prótons de acordo com os protocolos da instalação. Em seguida, ajuste os calços usando a sub-rotina do calço superior para otimizar a supressão do sinal do solvente.
Em seguida, calibre o pulso de prótons usando o programa P-OPT. Em seguida, calibre o pulso de 15N contra uma amostra padrão. Determine a atenuação correta para pulsos moldados usando a sub-rotina da ferramenta de forma.
Em seguida, abra o arquivo de forma de pulso apropriado clicando no ícone de pasta. Os pulsos em forma são encontrados na seção de parâmetros de pulso dos parâmetros de aquisição. Depois de carregar o arquivo de definição de pulso, clique em Analisar Forma de Onda, seguido por Integrar Forma.
Insira o próton calibrado pulso duro de 90 graus, o comprimento de pulso de forma desejado e a rotação. Em seguida, calcule o nível de potência do pulso em forma adicionando a mudança do nível de potência à atenuação para o pulso calibrado de 90 graus. Registre um HSQC de próton 15N padrão para otimizar a largura de varredura, a frequência da portadora e verificar a supressão de água.
Finalmente, ajuste a largura da varredura e o número de incrementos de dimensão indireta usando os comandos SW e TD ou diretamente nas caixas de diálogo apropriadas. Calibre os pulsos em forma conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, insira os comprimentos de pulso calibrados na seção de parâmetros de pulso na guia Parâmetros de aquisição.
Para medir o próton amida T2 usando a abordagem de dois pontos de atraso de tempo, defina os atrasos de tempo editando o arquivo de lista VD. O primeiro atraso é definido como 0,01 milissegundos. Usando a relação com o PRE máximo esperado, escolha o segundo atraso.
Em seguida, determine um valor adequado comparando os primeiros incrementos do primeiro e segundo espectros de atraso e ajustando o segundo atraso de tal forma que o sinal decaia para entre 40 a 50% do seu valor inicial. Determine o número de pontos complexos a serem registrados e o número de varreduras para obter uma média de sinal suficiente. Em seguida, use o comando EXPT para calcular o tempo de experimento e iniciar o experimento com o comando ZG. Depois de dissolver o ascorbato de sódio no tampão de RMN, ajuste o pH para corresponder ao do tampão de RMN original.
Em seguida, adicione o ácido ascórbico ao tubo de RMN em um excesso molar de 10 vezes sobre a concentração do rótulo de spin, colocando uma gotícula abaixo da borda do tubo. Tampe o tubo e inverta cuidadosamente para misturar. Gire a 200 a 400 G por 10 a 20 segundos em uma centrífuga manual para fixar a amostra no fundo do tubo.
Depois de envolver o tubo em papel alumínio, deixe a reação prosseguir por pelo menos três horas. Em seguida, registre o próton amida T2 na amostra diamagnética usando os mesmos parâmetros usados para a amostra paramagnética. Os PREs gama de prótons amida intramoleculares foram registrados em um fragmento auto-associado intrinsecamente desordenado derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR1.
Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação da etiqueta de spin sejam significativamente ampliados e não sejam detectáveis no espectro. Os resíduos que foram espaçados sequencialmente a partir do ponto de fixação, mas mostraram gama aumentada, estavam espacialmente próximos ao rótulo de spin. No caso de proteínas intrinsecamente desordenadas, o registro e a análise de purês produzirão informações sobre contatos intramoleculares e superfícies de interação transitórias.
A combinação de medições PRE com outros métodos biofísicos, como espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica e métodos computacionais, pode fornecer insights mais profundos. A medição do PRE auxilia na caracterização de um estado transitório escassamente povoado. Esta abordagem pode ser expandida para caracterizar interações importantes para uma miríade de processos biológicos, tais como reconhecimento molecular, seleção conformacional alostérica e processos de montagem, incluindo a montagem de organelas sem membrana via separação de fases.
