顺磁弛豫增强技术可用于表征和测量分子间距离，并量化瞬态和/或人口稀少的生物分子相互作用。在这里，我们应用这种技术来捕获蛋白质缩合之前的相互作用。PRE的灵敏度能够对其他NMR技术仍然不可见且无法获得的动态状态进行原子分辨率识别、检测和量化。
该方案的关键步骤包括去除未共轭的氮氧化物自旋标记并仔细分析光谱以准确测量峰高。此外，在核磁共振实验设置和脉冲校准期间必须谨慎。首先，从储备溶液中加入3-马来酰亚胺基-PROXYL，摩尔含量超过目标同位素标记蛋白的20倍。
在室温或四摄氏度下孵育过夜，避光避氧，轻轻摇动或章动。第二天，使用蛋白质样品的广泛透析或使用凝胶过滤来去除未反应的自由离心标记，以防止非特异性溶剂PRE。然后使用Ellman试剂定量溶液中的游离巯基。
使用酶标仪测量吸光度并构建标准曲线。为了测量分子内PRE，在适合NMR的缓冲液中制备浓度至少为100微摩尔但不大于300微摩尔的15N同位素富集自旋标记蛋白。然后使用长柄玻璃移液器或微量移液器，将NMR样品转移到适合高场磁体使用的5毫米NMR管中。
将样品放入磁铁中。使用锁定命令锁定氘信号，并根据设施协议调谐和匹配质子通道。然后使用顶部垫片子程序调整垫片，以优化溶剂信号抑制。
接下来，使用 P-OPT 程序校准质子脉冲。然后根据标准样品校准15N脉冲。使用形状工具子程序确定成形脉冲的正确衰减。
然后通过单击文件夹图标打开相应的脉冲形状文件。形状脉冲位于采集参数的脉冲参数部分。加载脉冲定义文件后，单击分析波形，然后单击积分形状。
输入校准的质子 90 度硬脉冲、所需形状脉冲长度和旋转。然后通过将功率电平的变化与校准的 90 度脉冲的衰减相加来计算成形脉冲的功率电平。记录标准质子 15N HSQC 以优化扫描宽度、载波频率并检查水抑制。
最后，使用 SW 和 TD 命令或直接在相应的对话框中调整扫描宽度和间接尺寸增量的数量。如前所述校准成形脉冲。然后在“采集参数”选项卡上的脉冲参数部分中输入校准的脉冲长度。
要使用两个时间延迟点方法测量酰胺质子T2，请通过编辑VD列表文件来设置时间延迟。第一个延迟设置为 0.01 毫秒。使用与预期最大 PRE 的关系，选择第二个延迟。
然后通过比较第一和第二延迟频谱的第一个增量并调整第二个延迟来确定合适的值，使信号衰减到其初始值的 40% 到 50% 之间。确定要记录的复杂点的数量以及足够的信号平均扫描次数。然后使用命令 EXPT 计算实验时间并使用命令 ZG 开始实验。将抗坏血酸钠溶解在NMR缓冲液中后，调整pH值以匹配原始NMR缓冲液的pH值。
然后通过在管边缘下方放置一个液滴，将抗坏血酸以超过自旋标记浓度的 10 倍摩尔过量添加到 NMR 管中。盖上试管，小心地倒置以混合。在手摇离心机中以 200 至 400 G 离心 10 至 20 秒，将样品沉降在管底部。
用箔纸包裹试管后，让反应进行至少三个小时。然后使用与顺磁性样品相同的参数在抗磁性样品上记录酰胺质子T2。分子内酰胺质子γ PRE记录在源自RNA结合蛋白EWSR1的低复杂性结构域的自缔合固有无序片段上。
与自旋标记连接点非常接近的残基预计将显着扩大，并且在光谱中无法检测到。从附着点依次间隔但显示增强γ的残基在空间上接近自旋标记。对于固有无序蛋白质，记录和分析果泥将产生有关分子内接触和瞬态相互作用表面的信息。
将 PRE 测量与其他生物物理方法（如动态光散射、体积排阻色谱、分析超速离心和计算方法）相结合，可以提供更深入的见解。PRE测量有助于表征瞬态稀疏状态。这种方法可以扩展到表征对无数生物过程重要的相互作用，例如分子识别，变构构象选择和组装过程，包括通过相分离组装无膜细胞器。
