Paramanyetik gevşeme geliştirme tekniği, moleküller arası mesafeleri karakterize etmek ve ölçmek ve geçici ve/veya düşük nüfuslu biyomoleküler etkileşimleri ölçmek için kullanılabilir. Burada, protein yoğunlaşmasından önceki etkileşimleri yakalamak için bu tekniği uyguladık. PRE'lerin hassasiyeti, diğer NMR teknikleri tarafından görünmez ve erişilemez kalan dinamik durumun atomik çözünürlüğün tanımlanmasını, algılanmasını ve ölçülmesini sağlar.
Bu protokoldeki temel adımlar, konjuge olmayan nitroksit spin etiketinin çıkarılmasını ve tepe yüksekliğini doğru bir şekilde ölçmek için spektrumların dikkatlice analiz edilmesini içerir. Ek olarak, NMR deney kurulumu ve darbe kalibrasyonu sırasında dikkatli olunmalıdır. Başlamak için, ilgilenilen 15N izotopik olarak etiketlenmiş proteinin 20 katı molar fazlalığında bir stok çözeltisinden 3-maleimido-PROXYL ekleyin.
Gece boyunca oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede, ışıktan ve oksijenden korunarak ve hafif sallanma veya nütasyon ile inkübe edin. Ertesi gün, protein örneğinin kapsamlı diyalizini veya jel filtrasyonunu kullanarak spesifik olmayan çözücü PRE'yi önlemek için reaksiyona girmemiş serbest sıkma etiketini çıkarın. Ardından, çözeltideki serbest sülfhidril gruplarını ölçmek için Ellman reaktifini kullanın.
Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı ölçün ve standart eğriyi oluşturun. Molekül içi PRE'yi ölçmek için, NMR için uygun bir tamponda en az 100 mikromolar, ancak 300 mikromolar'dan fazla olmayan bir konsantrasyona 15N izotopik olarak zenginleştirilmiş spin etiketli protein hazırlayın. Daha sonra uzun saplı bir cam pipet veya mikropipet kullanarak NMR numunesini yüksek alanlı mıknatıslarda kullanıma uygun beş milimetrelik bir NMR tüpüne aktarın.
Numuneyi mıknatısa yerleştirin. Lock komutunu kullanarak döteryum sinyalini kilitleyin ve proton kanalını tesis protokollerine göre ayarlayın ve eşleştirin. Ardından, solvent sinyali bastırmayı optimize etmek için üst şim alt yordamını kullanarak şimleri ayarlayın.
Ardından, P-OPT programını kullanarak proton darbesini kalibre edin. Ardından 15N darbeyi standart bir örneğe göre kalibre edin. Şekil aracı alt yordamını kullanarak şekilli darbeler için doğru zayıflamayı belirleyin.
Ardından klasör simgesine tıklayarak uygun darbe şekli dosyasını açın. Şekillendirilmiş darbeler, toplama parametrelerinin darbe parametreleri bölümünde bulunur. Darbe tanımlama dosyasını yükledikten sonra, Dalga Formunu Analiz Et'e ve ardından Şekli Entegre Et'e tıklayın.
Kalibre edilmiş proton 90 derece sert darbeyi, istenen şekil darbe uzunluğunu ve dönüşü girin. Ardından, kalibre edilmiş 90 derecelik darbe için zayıflamaya güç seviyesi değişikliğini ekleyerek şekillendirilmiş darbenin güç seviyesini hesaplayın. Süpürme genişliğini, taşıyıcı frekansını optimize etmek ve su bastırmayı kontrol etmek için standart bir proton 15N HSQC kaydedin.
Son olarak, SW ve TD komutlarını kullanarak veya doğrudan uygun iletişim kutularında tarama genişliğini ve dolaylı boyut artışlarının sayısını ayarlayın. Şekilli darbeleri daha önce gösterildiği gibi kalibre edin. Ardından, Toplama Parametreleri sekmesindeki darbe parametreleri bölümüne kalibre edilmiş darbe uzunluklarını girin.
Amid proton T2'yi iki zaman gecikme noktası yaklaşımını kullanarak ölçmek için, VD liste dosyasını düzenleyerek zaman gecikmelerini ayarlayın. İlk gecikme 0,01 milisaniye olarak ayarlanmıştır. Beklenen en yüksek PRE ile ilişkiyi kullanarak ikinci gecikmeyi seçin.
Ardından, birinci ve ikinci gecikme spektrumlarının ilk artışlarını karşılaştırarak ve ikinci gecikmeyi, sinyal başlangıç değerinin %40 ila %50'si arasında düşecek şekilde ayarlayarak uygun bir değer belirleyin. Yeterli sinyal ortalaması için kaydedilecek karmaşık noktaların sayısını ve tarama sayısını belirleyin. Ardından deney süresini hesaplamak için EXPT komutunu kullanın ve denemeyi ZG komutuyla başlatın. Sodyum askorbat NMR tamponunda çözüldükten sonra, pH'ı orijinal NMR tamponununkine uyacak şekilde ayarlayın.
Daha sonra askorbik asidi, tüpün kenarının altına bir damlacık yerleştirerek, spin etiketinin konsantrasyonunun 10 katı molar fazlalıkta NMR tüpüne ekleyin. Tüpü kapatın ve karıştırmak için dikkatlice ters çevirin. Numuneyi tüpün dibine yerleştirmek için elle çalıştırılan bir santrifüjde 10 ila 20 saniye boyunca 200 ila 400 G'de döndürün.
Tüpü folyoya sardıktan sonra, reaksiyonun en az üç saat devam etmesine izin verin. Ardından, paramanyetik numune için kullanılan aynı parametreleri kullanarak diyamanyetik numune üzerine amid proton T2'yi kaydedin. Molekül içi amid proton gamaları PRE'leri, RNA bağlayıcı protein EWSR1'in düşük karmaşıklık alanından türetilen, kendi kendini ilişkilendiren, içsel olarak düzensiz bir fragman üzerine kaydedildi.
Döndürme etiketi bağlantı noktasına yakın sıralı kalıntıların önemli ölçüde genişlemesi beklenir ve spektrumda tespit edilemez. Bağlantı noktasından sıralı olarak aralıklı olan ancak gelişmiş gama gösteren kalıntılar, uzamsal olarak spin etiketine yakındı. Doğası gereği düzensiz proteinler söz konusu olduğunda, pürelerin kaydedilmesi ve analiz edilmesi, molekül içi temaslar ve geçici etkileşim yüzeyleri hakkında bilgi verecektir.
PRE ölçümlerini dinamik ışık saçılımı, boyut dışlama kromatografisi, analitik ultrasantrifüjleme ve hesaplama yöntemleri gibi diğer biyofiziksel yöntemlerle birleştirmek daha derin içgörüler sağlayabilir. PRE ölçümü, geçici seyrek nüfuslu durumu karakterize etmeye yardımcı olur. Bu yaklaşım, moleküler tanıma, allosterik konformasyonel seleksiyon ve faz ayırma yoluyla zarsız organellerin birleştirilmesi de dahil olmak üzere montaj süreçleri gibi sayısız biyolojik süreç için önemli olan etkileşimleri karakterize etmek için genişletilebilir.
