يمكن استخدام تقنية تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لتوصيف وقياس المسافات بين الجزيئات وتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية العابرة و / أو منخفضة السكان. هنا ، طبقنا هذه التقنية لالتقاط التفاعلات التي تسبق تكثيف البروتين. تتيح حساسية PREs تحديد الدقة الذرية والكشف والقياس الكمي للحالة الديناميكية التي تظل غير مرئية ولا يمكن الوصول إليها لتقنيات الرنين المغناطيسي النووي الأخرى.
تتضمن الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول إزالة ملصق دوران النيتروكسيد غير المقترن وتحليل الأطياف بعناية لقياس ارتفاع الذروة بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر أثناء إعداد تجربة الرنين المغناطيسي النووي ومعايرة النبض. للبدء ، أضف 3-maleimido-PROXYL من محلول مخزون عند 20 مرة زيادة مولية من البروتين المسمى نظائريا 15N محل الاهتمام.
احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية محمية من الضوء والأكسجين ومع هزاز لطيف أو nutation. في اليوم التالي ، قم بإزالة ملصق الدوران الحر غير المتفاعل لمنع المذيب غير المحدد PRE باستخدام إما غسيل الكلى الشامل لعينة البروتين أو باستخدام ترشيح الهلام. ثم استخدم كاشف إيلمان لتحديد مجموعات سلفهيدريل الحرة في المحلول.
قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم ببناء المنحنى القياسي. لقياس PRE، قم بإعداد بروتين 15N المخصب بالنظائر المسمى بتركيز لا يقل عن 100 ميكرومولار ، ولكن ليس أكثر من 300 ميكرومولار ، في مخزن مؤقت مناسب للرنين المغناطيسي النووي. ثم باستخدام ماصة زجاجية طويلة الساق أو ماصة دقيقة ، انقل عينة الرنين المغناطيسي النووي إلى أنبوب NMR بخمسة ملليمترات مناسب للاستخدام في المغناطيسات عالية المجال.
ضع العينة في المغناطيس. قفل على إشارة الديوتيريوم باستخدام أمر القفل وتناغم ومطابقة قناة البروتون وفقا لبروتوكولات المنشأة. ثم اضبط الحشوات باستخدام الروتين الفرعي العلوي للرقاقة لتحسين قمع إشارة المذيبات.
بعد ذلك ، قم بمعايرة نبضة البروتون باستخدام برنامج P-OPT. ثم قم بمعايرة نبضة 15N مقابل عينة قياسية. حدد التوهين الصحيح لنبضات الشكل باستخدام الروتين الفرعي لأداة الشكل.
ثم افتح ملف شكل النبض المناسب بالنقر فوق رمز المجلد. تم العثور على النبضات المشكلة في قسم معلمات النبض لمعلمات الاستحواذ. بعد تحميل ملف تعريف النبض ، انقر فوق تحليل الشكل الموجي ، متبوعا بدمج الشكل.
أدخل النبضة الصلبة للبروتون المعاير 90 درجة ، وطول نبضة الشكل المطلوب ، والدوران. ثم احسب مستوى طاقة النبضة المشكلة عن طريق إضافة تغيير مستوى الطاقة إلى التوهين للنبضة المعايرة 90 درجة. سجل بروتون قياسي 15N HSQC لتحسين عرض المسح وتردد الموجة الحاملة والتحقق من قمع المياه.
أخيرا، اضبط عرض الاجتياح وعدد زيادات الأبعاد غير المباشرة باستخدام أوامر SW وTD أو مباشرة في شاشات التشغيل المناسبة. معايرة النبضات المشكلة كما هو موضح سابقا. ثم أدخل أطوال النبضات المعايرة في قسم معلمات النبض في علامة التبويب معلمات الاكتساب.
لقياس بروتون الأميد T2 باستخدام نهج نقطتي تأخير زمنيتين ، اضبط التأخيرات الزمنية عن طريق تحرير ملف قائمة VD. يتم ضبط التأخير الأول على 0.01 مللي ثانية. باستخدام العلاقة إلى الحد الأقصى المتوقع ل PRE، اختر التأخير الثاني.
ثم حدد قيمة مناسبة من خلال مقارنة الزيادات الأولى من أطياف التأخير الأول والثاني وضبط التأخير الثاني بحيث تضمحل الإشارة إلى ما بين 40 إلى 50٪ من قيمتها الأولية. حدد عدد النقاط المعقدة المراد تسجيلها وعدد عمليات المسح للحصول على متوسط إشارة كاف. ثم استخدم الأمر EXPT لحساب وقت التجربة وبدء التجربة باستخدام الأمر ZG. بعد إذابة أسكوربات الصوديوم في المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمطابقة المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي الأصلي.
ثم أضف حمض الأسكوربيك إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي عند زيادة مولية 10 مرات فوق تركيز ملصق الدوران عن طريق وضع قطرة أسفل حافة الأنبوب. قم بتغطية الأنبوب واقلبه بعناية للخلط. تدور عند 200 إلى 400 جم لمدة 10 إلى 20 ثانية في جهاز طرد مركزي يدوي لتسوية العينة في قاع الأنبوب.
بعد لف الأنبوب بورق ، اترك التفاعل يستمر لمدة ثلاث ساعات على الأقل. ثم سجل أميد بروتون T2 على العينة المغناطيسية باستخدام نفس المعلمات المستخدمة للعينة البارامغناطيسية. تم تسجيل أميد بروتون جاما داخل الجزيئات على جزء مضطرب جوهريا مرتبط ذاتيا مشتق من مجال التعقيد المنخفض لبروتين ربط الحمض النووي الريبي EWSR1.
من المتوقع أن يتم توسيع المخلفات القريبة من نقطة ربط ملصق الدوران بشكل كبير ولا يمكن اكتشافها في الطيف. كانت البقايا التي كانت متباعدة بالتتابع من نقطة التعلق ولكنها أظهرت جاما محسنة قريبة مكانيا من ملصق الدوران. في حالة البروتينات المضطربة جوهريا ، فإن تسجيل وتحليل الهريس سينتج عنه معلومات حول الاتصالات داخل الجزيئات وأسطح التفاعل العابرة.
يمكن أن يوفر الجمع بين قياسات PRE والطرق الفيزيائية الحيوية الأخرى مثل تشتت الضوء الديناميكي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والطرد المركزي الفائق التحليلي ، والطرق الحسابية رؤى أعمق. يساعد قياس PRE في توصيف الحالة العابرة ذات الكثافة السكانية المنخفضة. يمكن توسيع هذا النهج لتوصيف التفاعلات المهمة لعدد لا يحصى من العمليات البيولوجية مثل التعرف الجزيئي ، والانتقاء التوافقي الخيفي ، وعمليات التجميع بما في ذلك تجميع العضيات الخالية من الأغشية عن طريق فصل الطور.
